Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster
Summary
Integriteit van de bloed-hersen barrière is essentieel voor de functie van het zenuwstelsel. In Drosophila melanogasterwordt de bloed-hersen barrière gevormd door gliacellen tijdens de late embryogenese. Dit protocol beschrijft methoden voor het testen van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière in D. melanogaster -embryo’s en derde instar larven.
Abstract
Goede ontwikkeling van het zenuwstelsel omvat de vorming van de bloed-hersen barrière, de diffusie barrière die strak regelt de toegang tot het zenuwstelsel en beschermt zenuwweefsel tegen toxines en pathogenen. Defecten in de vorming van deze barrière zijn gecorreleerd met neuropathieën, en de afbraak van deze barrière is waargenomen bij veel neurodegeneratieve ziekten. Daarom is het van cruciaal belang om de genen te identificeren die de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière reguleren om mogelijke therapeutische doelen te identificeren. Om de exacte rollen die deze genen spelen in neurale ontwikkeling te begrijpen, is het noodzakelijk om de effecten van veranderde genexpressie op de integriteit van de bloed-hersen barrière te testen. Veel van de moleculen die functioneren in de oprichting van de bloed-hersen barrière zijn gevonden om te worden bewaard over eukaryotische soorten, met inbegrip van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster. Fruit vliegjes hebben bewezen een uitstekend modelsysteem te zijn voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel reguleren. Dit protocol beschrijft een stapsgewijze procedure voor de bepaling van de integriteit van de bloed-hersen barrière tijdens de embryonale en larvale stadia van de ontwikkeling van D. melanogaster .
Introduction
Tijdens de ontwikkeling, cel-cel communicatie en interacties zijn van cruciaal belang voor de oprichting van weefsel en orgaan structuur en functie. In sommige gevallen sluiten deze celcelinteracties organen af van de omringende omgeving om een goede orgaanfunctie te waarborgen. Dit is het geval voor het zenuwstelsel, die is geïsoleerd door de bloed-hersen barrière (BBB). Dysfunctie van de BBB bij mensen is gekoppeld aan neurologische aandoeningen zoals epilepsie, en afbraak van de barrière is waargenomen bij neurodegeneratieve ziekten, waaronder multiple sclerose en Amyotrofische laterale sclerose1. Bij zoogdieren wordt de BBB gevormd door nauwe kruisingen tussen endotheliale cellen2,3. Andere dieren, waaronder de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, hebben een BBB samengesteld uit gliacellen. Deze gliacellen vormen een selectieve permeabele barrière om de beweging van nutriënten, afvalproducten, toxines en grote moleculen in en uit het zenuwstelsel te controleren4. Dit zorgt voor het onderhoud van de elektrochemische gradiënt die nodig is om brand actie potentialen, waardoor mobiliteit en coördinatie4. In D. melanogasterbeschermen de glia het zenuwstelsel tegen de kalium-rijke, bloed achtige Hemolymfe5.
In het centrale zenuwstelsel (CZS) en het perifere zenuwstelsel (PNS) van D. melanogaster, twee buitenste gliale lagen, de subperineurale glia en de perineuriële glia, evenals een buiten netwerk van extracellulaire matrix, de neurale lamella, vormen de Hemolymfe-hersenen en Hemolymfe-zenuw barrière6, aangeduid als de BBB in dit artikel. Tijdens de ontwikkeling subperineuriële glia worden polyploïde en vergroten om het zenuwstelsel te omringen5,6,7,8,9,10,11 . De subperineurale glia vormen septate-kruisingen, die de belangrijkste diffusie barrière tussen de Hemolymfe en het zenuwstelsel5,6,12bieden. Deze kruispunten zijn moleculair vergelijkbaar met de septate-achtige kruispunten gevonden bij de paranodes van myelinerende glia in gewervelde dieren, en ze voeren dezelfde functie als nauwe kruisingen in de BBB van zoogdier13,14, 15 , 16 , 17. de perineuriële glia verdelen, groeien en wikkelen rond de subperineurale glia om de diffusie van metabolieten en grote moleculen6,10,18,19te reguleren. De vorming van BBB is voltooid door 18,5 h na het leggen van eieren (AEL) bij 25 °c5,8. Eerdere studies hebben genen geïdentificeerd die kritische regulatoren zijn van BBB-formatie20,21,22. Om de precieze rollen van deze genen beter te begrijpen, is het belangrijk om het effect van mutatie van deze potentiële regulatoren op BBB-integriteit te onderzoeken. Terwijl eerdere studies hebben geschetst benaderingen voor het aszeggen van BBB integriteit in embryo’s en larven, een uitgebreid protocol voor deze assay moet nog worden beschreven5,7. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de methoden voor het aszeggen van BBB-integriteit tijdens D. melanogaster embryonale en derde INSTAR larvale stadia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol bevat een uitgebreide beschrijving van de stappen die nodig zijn om de integriteit van BBB te testen tijdens de late embryonale en derde INSTAR larvale stadia van de ontwikkeling van D. melanogaster . Soortgelijke benaderingen zijn elders beschreven om te testen van de integriteit van de BBB tijdens de ontwikkeling, evenals in volwassen stadia5,7,29,30. Beschrijvingen van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. F. Bryan Pickett en Dr. Rodney Dale voor het gebruik van apparatuur voor injectie. Dit werk werd gefinancierd door onderzoeksfinanciering van Loyola University Chicago naar M.D., D.T. en J.J.
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
References
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin–novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- . BDSC Cornmeal Food Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017)
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
