Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Zellen im erwachsenen Zentralnervensystem, wo sie einzigartige entwicklungs- und heimostatische Funktionen ausführen¹. Astrozyten modulieren synaptische Entwicklung durch direkten Kontakt mit prä- und postsynaptischen Terminals als Teil der Tripartit-Synapse, die Neurotransmitter-Rezeptoren, Transporter und Zelladhäsionsmoleküle enthält, die die Synapsenbildung erleichtern und Neuron-Astrozyten-Kommunikation². Darüber hinaus steuern Astrozyten aktiv die synaptische Übertragung und verhindern neuronale Exzitotoxizität, indem sie exzitatorische Neurotransmitter schnell aus dem synaptischen Spalten entfernen, Neurotransmitter recyceln und an synaptischem Schnitt teilnehmen^{3 , 4 , 5 , 6}. Um diese hochinteraktiven Funktionen zu ermöglichen, kommunizieren Astrozyten untereinander, mit anderen Gliazellen und mit Neuronen durch spezialisierte Membranproteine, einschließlich Zelladhäsionsmoleküle, Aquaporine, Ionenkanäle, Neurotransmitter-Transporter und Lückenknotenmoleküle. Astrozyten verändern aktiv die Oberflächenniveaus dieser Proteine als Reaktion auf Schwankungen in ihrer intra- und extrazellulären Umgebung⁷. Darüber hinaus modulieren Veränderungen in den Konzentrationen und der Verteilung von Mitochondrien, Lipidtröpfchen und abbauenden und recycelnden Organellen die Energieversorgung, die Verfügbarkeit von Metaboliten und zelluläre Clearingprozesse, die für die Astrozytenfunktion und überleben.

Die dynamischen Veränderungen des Membranprotein- und Organellenhandels und der Positionierung in Astrozyten werden durch die konzertierte Funktion von motorischen Proteinen und Adaptern erleichtert, die die Beweglichkeit^derLadung 8^,9fördern. In ähnlicher Weise werden die Oberflächenniveaus von Membranproteinen durch Internalisierung simonieren und Recyceln¹⁰moduliert. Diese Ladungen werden über ein kompliziertes Netz von Actin, Mikrotubuliund möglicherweise Zwischenfilamenten 8 transportiert. Studien auf der Grundlage der Immunfluoreszenzfärbung des Endbindungsproteins 1 (EB1), das sich an den wachsenden Mikrotubuli plus Enden ansammelt, deuten darauf hin, dass in Astrozyten Bündel von Mikrotubuli aus dem Perinucleus ausstrahlen und ihr Plus-Ende in Richtung Peripherie¹¹. Eine umfassende Untersuchung der Organisation und Polarität von Mikrotubuli und anderen zytoskelettalen Elementen mittels Live-Zell-Bildgebung fehlt jedoch noch. Während viele der Mechanismen, die der Dynamik von Organellen und Membranproteinen zugrunde liegen, ausgiebig in Neuronen und anderen Zelltypen untersucht wurden, ist die Beweglichkeit der Ladung in Astrozyten weniger gut verstanden. Der größte Teil unseres derzeitigen Wissens über Veränderungen der Protein- und Organellenverteilung in Astrozyten basiert auf der traditionellen Antikörper-basierten Kennzeichnung fester Zubereitung, die eine genaue räumliche und zeitliche Untersuchung der Ladungsdynamik ausschließt^{7, 12}.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung von Membranproteinen und Organellen für live-Bildgebung in hochreinen primären Maus-Astrozytenkulturen. Anhand dieses Protokolls liefern wir Beispiele, in denen wir die dynamische Lokalisierung von grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP) verfolgen, die mit Membranproteinen in transfizierten Astrozyten getaggt sind, einschließlich des Spaltknotenproteins Connexin 43 (Cx43-GFP) und der exzitatorischen Aminosäure Transporter 1 (EAAT1-GFP). Wir beschreiben auch die Verwendung einer fluoreszierenden säureotropen Sonde, um saure Organellen zu visualisieren und deren Handelsdynamik in lebenden Astrozyten zu verfolgen. Abschließend zeigen wir, wie die Zeitrafferdaten analysiert werden, um Transportparameter für einzelne Ladungen zu extrahieren und auszuwerten.