Un protocolo de Cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno
Summary
Se desarrolló un método de pulverización criogénica para procesar patas murinas utilizando un molino congelador de nitrógeno líquido para mejorar el rendimiento y la calidad del ARN o proteína extraída de los tejidos y permitir el análisis de perfiles moleculares asociados con Respuestas.
Abstract
La elaboración de perfiles de cambios moleculares en los tejidos locales es crucial para comprender los mecanismos de acción de los candidatos terapéuticos in vivo. En el campo de la investigación de la artritis, muchos estudios se centran en las articulaciones inflamadas que se componen de una mezcla compleja de hueso, cartílago, músculo, células estromales y células inmunitarias. Aquí, establecimos un método mecánico fiable y robusto para interrumpir las patas de ratón inflamadas en muestras pulverizadas homogéneas en un entorno croogénicamente controlado. Se procesaron lelíforos de proteínas y ARN para permitir las variables proteómicas y transcripcionales y la caracterización molecular de las vías de enfermedad relevantes en el tejido local.
Introduction
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria sistémica crónica con sinovitis simétrica persistente en las articulaciones y afectación articular adicional de órganos como la piel, el corazón, los pulmones y los ojos1. Aunque las manifestaciones sistémicas de la respuesta inmunitaria son evidentes en pacientes humanos, una de las señas de identidad de la patología de la AR es la infiltración de células inmunitarias en el tejido sinovial y la proliferación de células fibroblastos sinoviales2.
Al igual que la AR humana, el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón (CIA) provoca una fuerte inflamación del tejido con respuestas inmunitarias activas en tejidos sinoviales y compartimentos sistémicos. La susceptibilidad de diferentes cepas de ratón a los enlaces del modelo CIA a los principales haplotipos del Complejo histocompatibilidad (MHC) y las interacciones específicas del antígeno T y de la célula B3,4. Además, muchas vías patógenas en la AR humana, incluyendo la producción de autoanticuerpos, deposición del complejo inmune, activación de células mieloides, manifestaciones poliarticulares y formación de pannus con infiltración inmune sinovial, también son evidentes en este modelo 5,6. Los investigadores han empleado este modelo bien establecido de la CIA para investigar los efectos de los tratamientos antiinflamatorios de citoquinas7. Muchos productos biológicos aprobados para enfermedades autoinmunes o inflamatorias, tales como anti-TNF y anti-IL-6, se encuentran para ser eficaces en el modelo de la CIA8,9.
La elaboración de perfiles de las interacciones del sistema inmunitario en el tejido sinovial es crucial para dilucidar los mecanismos moleculares asociados con la patogénesis de la AR. En el entorno clínico humano, una práctica común es realizar biopsias sinoviales de aguja bajo la guía de imágenes por ultrasonido. En los entornos preclínicos, la arquitectura más pequeña de las articulaciones murinas hace que los procedimientos de biopsia sean mucho más difíciles si no imposibles. Recientemente, demostramos la utilización del modelo de la CIA murina para evaluar combinaciones de fármacos para impactar puntos finales dispares y resolver enfermedades en un enfoque combinatorio10. Se empleó un método de pulverización a base de molino de congelador criogénico para procesar patas murinos inflamadas en polvos finos homogéneos y estableció procesos aguas abajo para extraer ARN y proteínas. Este método protege el ARN y las proteínas de los procesos de degrativos enzimáticos y químicos y nos permite aplicar múltiples métodos analíticos a una sola fuente de muestra homogeneizada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque existe una sólida lógica científica para evaluar las vías moleculares en los tejidos sinoviales, muchos informes sobre el perfil inmune del modelo de la CIA murina se centraron en la sangre periférica, mientras que los datos de análisis de proteínas y ARN de las patas inflamadas son bastante limitados. Hay varias razones posibles para este sesgo: las articulaciones del tobillo murino no son más grandes que 2 cm; las zonas afectadas consisten en piel, hueso y tejidos conectivos que a menudo son difíciles d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Edith Janssen la revisión crítica del manuscrito y a Navin Rao y Jennifer Towne por su apoyo a la publicación de este manuscrito.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
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