Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno
Summary
Um método criogênico de pulverização para processar patas de urina usando um moinho congelador de nitrogênio líquido foi desenvolvido para melhorar o rendimento e a qualidade do RNA ou proteína extraído dos tecidos e permitir a análise de perfis moleculares associados a inflamatórios Respostas.
Abstract
O perfil de alterações moleculares nos tecidos locais é crucial para entender o mecanismo de ação dos candidatos terapêuticos in vivo. No campo da pesquisa da artrite, muitos estudos são focalizados nas junções inflamadas que são compostas de uma mistura complexa do osso, da cartilagem, do músculo, das pilhas estromais e das pilhas imunes. Aqui, estabelecemos um método mecânico confiável e robusto para interromper as patas inflamadas do rato em amostras pulverizadas homogêneas em um ambiente criogenicamente controlado. As lisatas proteicas e rna foram processadas para permitir desfechos proteômicos e transcricionais e caracterização molecular de vias de doenças relevantes no tecido local.
Introduction
A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória sistêmica crônica com sinofite simétrica persistente nas articulações e envolvimento articular extra de órgãos como a pele, coração, pulmões e olhos1. Embora as manifestações sistêmicas da resposta imune sejam evidentes em pacientes humanos, uma das características da patologia da RA é a infiltração de células imunes no tecido sinovial e a proliferação de células fibroblastas sinoviais2.
Semelhante ao AR humano, o modelo de artrite induzida por colágeno do rato (CIA) provoca forte inflamação do tecido com respostas imunes ativas em tecidos sinoviais e compartimentos sistêmicos. A susceptibilidade de diferentes cepas de camundongos para links modelo da CIA para Major Histocompatibilidade Complexo (MHC) haplótipo e antígeno específico célula T e interações celulares B3,4. Além disso, muitas vias patogênicas na AR humana, incluindo a produção de autoanticorpos, deposição de complexo imune, ativação de células mieloides, manifestações poliarticulares e formação de pannus com infiltração imune sinovial, também são evidentes neste modelo 5,6. Os investigadores empregaram este modelo bem estabelecido do CIA para investigar efeitos de tratamentos anti-inflamatórios da citocina7. Muitos produtos biológicos aprovados para doenças auto-imunes ou inflamatórias, como anti-TNFα e anti-IL-6, são encontrados para ser eficaz no modelo da CIA8,9.
O perfil das interações do sistema imunológico no tecido sinovial é crucial para elucidar os mecanismos moleculares associados à patogênese da AR. No ambiente clínico humano, uma prática comum é realizar biópsias sinoviais de agulha a orientação de imagens de ultrassom. Nas configurações pré-clínicas, a arquitetura menor das articulações de urina torna os procedimentos de biópsia muito mais difíceis, se não impossíveis. Recentemente, demonstramos a utilização do modelo murine CIA para avaliar combinações de drogas para impactar pontos finais díspares e resolver a doença em uma abordagem combinatória10. Um método criogênico de pulverização à base de uma fábrica de freezer foi empregado para processar patas de urina inflamadas em pós finos homogêneos e estabeleceu processos a jusante para extrair RNA e proteínas. Este método protege o RNA e a proteína dos processos degralísticos enzimáticos e químicos e permite-nos aplicar múltiplos métodos analíticos a uma única fonte homogênea da amostra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora haja uma forte lógica científica para avaliar as vias moleculares nos tecidos sinoviais, muitos relatórios sobre o perfil imunológico do modelo da CIA murine foram focados no sangue periférico, enquanto os dados de análise de proteínas e RNA de patas inflamadas são bastante limitados. Existem várias razões possíveis para este viés: as articulações do tornozelo murine não são maiores do que ~ 2 cm; as áreas afetadas consistem em tecidos de pele, osso e conjuntivo, que muitas vezes são difíceis de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer a Edith Janssen pela revisão crítica do manuscrito e Navin Rao e Jennifer Towne por seu apoio à publicação deste manuscrito.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
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