Un protocollo di criopulverizzazione per l'elaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene
Summary
È stato sviluppato un metodo criogenico di polverizzazione per la trattamento delle zampe murine utilizzando un congelatore liquido congelatore di azoto per migliorare la resa e la qualità dell’RNA o delle proteine estratte dai tessuti e consentire l’analisi dei profili molecolari associati agli infiammatori Risposte.
Abstract
Profilare i cambiamenti molecolari nei tessuti locali è fondamentale per comprendere i meccanismi di azione dei candidati terapeutici in vivo. Nel campo della ricerca sull’artrite, molti studi si concentrano sulle articolazioni infiammate che sono composte da una complessa miscela di ossa, cartilagine, muscoli, cellule stromali e cellule immunitarie. Qui, abbiamo stabilito un metodo meccanico affidabile e robusto per interrompere le zampe di topo infiammate in campioni polverizzati omogenei in un ambiente controllato criogenicamente. Le proteine e i lysati di RNA sono stati elaborati per consentire gli endpoint proteomici e trascrittivi e la caratterizzazione molecolare delle vie di malattia rilevanti nel tessuto locale.
Introduction
L’artrite reumatoide (RA) è una malattia infiammatoria sistemica cronica con sinovite simmetriche persistenti nelle articolazioni e coinvolgimento extra articolare di organi come la pelle, il cuore, i polmoni e gli occhi1. Anche se le manifestazioni sistemiche della risposta immunitaria sono evidenti nei pazienti umani, uno dei segni distintivi della patologia RA è l’infiltrazione delle cellule immunitarie nel tessuto sinoviale e la proliferazione delle cellule fibroblaste sinoviali2.
Simile all’AR umana, il modello di artrite indotta dal collagene di topo (CIA) suscita una forte infiammazione tissutale con risposte immunitarie attive nei tessuti sinoviali e nei compartimenti sistemici. La suscettibilità di diversi ceppi di mouse al modello CIA si collega all’aplotipo del complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) e alle interazioni specifiche delle cellule T e delle cellule B3,4. Inoltre, molte vie patogene nell’AR umana, tra cui la produzione di autoanticorpi, deposizione del complesso immunitario, attivazione delle cellule mieloidi, manifestazioni poliuacolari e formazione di pannus con infiltrazione immunitaria sinoviale, sono anche evidenti in questo modello 5,6. Gli investigatori hanno impiegato questo modello ben consolidato CIA per studiare gli effetti dei trattamenti citochini antinfiammatori7. Molti biologici omologati per le malattie autoimmuni o infiammatorie, come anti-TNF e anti-IL-6, sono trovati per essere efficace nel modello CIA8,9.
Profilare le interazioni del sistema immunitario nel tessuto sinoviale è fondamentale per chiarire i meccanismi molecolari associati alla patogenesi dell’AR. Nell’ambiente clinico umano, una pratica comune è quella di eseguire biopsie sinoviali dell’ago sotto la guida dell’imaging a ultrasuoni. Negli ambienti preclinici, l’architettura più piccola delle articolazioni murine rende le procedure di biopsia molto più difficili se non impossibili. Recentemente, abbiamo dimostrato l’utilizzo del modello murine CIA per valutare combinazioni di farmaci per influenzare diversi endpoint e risolvere la malattia in un approccio combinatorio10. È stato utilizzato un metodo di polverizzazione criogenico basato sul mulino a congelatore per elaborare le zampe murine infiammate in polveri fini omogenee e stabilire processi a valle per estrarre RNA e proteine. Questo metodo protegge l’RNA e le proteine dai processi degrativi enzimatici e chimici e ci consente di applicare più metodi analitici a una singola fonte di campione omogenea.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se c’è una forte logica scientifica per valutare le vie molecolari nei tessuti sinoviali, molte segnalazioni sulla profilazione immunitaria del modello della CIA murina erano focalizzate sul sangue periferico, mentre i dati di analisi delle proteine e dell’RNA delle zampe infiammate sono piuttosto limitati. Ci sono diverse possibili ragioni per questo pregiudizio: le articolazioni della caviglia murina non sono più grandi di 2 cm; le aree colpite sono costituite da tessuti cutanei, ossei e connettivi che sono spe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Edith Janssen per la revisione critica del manoscritto e Navin Rao e Jennifer Towne per il loro sostegno alla pubblicazione di questo manoscritto.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
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