オルガノイド培養を用いたマウス前立腺上皮細胞の分化能力の評価

ここで説明するすべての方法は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の機関審査委員会によって承認されています。 注:このホワイト ペーパーに記載されているアプローチを示す概略図を図 1に示します。 1. 蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いたマウス基底細胞および発光前立腺上皮細胞の単離 — タイミング:30分 注:暗闇の中でステップ1.3~1.5を実行します。 Lawson et al.16に記載の全マウス前立腺から細胞を解離した後、細胞をFACSチューブに移し、解離媒体の100μLで0.1〜5×106細胞を再中断する(表1)。 CD45、CD31、Ter-119、EpCAM、CD49fの直接共役一次抗体の適切な体積を追加します。 氷の上で20分間、光から保護されます。注:未染色および単染色されたコントロールには、全解解除細胞の10%を利用することをお勧めします。これらのコントロールは、ソートのための正しい補正と電圧を設定するために必要です。 各サンプルに解離媒体を1mL添加して抗体カクテルをクエンチする。室温(RT)で5分間800xgで遠心分離して細胞をペレットし、吸引して上清を除去する。 1μg/mL 4′,6-ジアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)を含む解離媒体の適切なボリューム(1 x 106細胞あたり250°L)で細胞を再サスペンドします。FACS に進みます。マウス基底および明るい前立腺上皮細胞の単離を示すフローサイトメトリープロットを図2に示す。 2. めっき前立腺上皮細胞を原発マウスオルガノイド培養に — TIMING: 2-3 H (ポリHEMA被覆プレート調製を除く) 注:プレートは、マトリックスゲルの下の井戸の表面に2Dコロニー形成を防ぐためにポリヘマでコーティングされています。ポリHEMAコーティングプレートを1日前に調製し、マウスオルガノイド培養に基底または発光前立腺上皮細胞をめっきする。還元成長因子マトリックスゲルの1mLアリコートを解凍し、続後、マトリックスゲルと呼び、ステップ2.1の前に氷2時間上に。Y-27632(ROCK阻害剤)は、ステップ2.1の直前にマウスオルガノイドメディアに添加する必要があります。氷上でステップ2.1~2.8を実行します。 細胞を5mL丸底チューブにペレットし、800 x gで遠心分離し、4°Cで5分間、上清を吸引する。 マウスオルガノイドメディアの500μLで細胞ペレットを洗浄する(表2)14. 細胞を800xgで遠心分離して4°Cで5分間ペレット化し、上清を吸引する。 1,000細胞/μLの細胞密度でマウスオルガノイドメディアに再サスペンド。 マスターミックスを調製するには、マウスオルガノイド媒体に懸濁した上皮細胞をマトリックスゲルと混合し、25%の細胞/媒体および75%マトリックスゲルを含む最終混合物を生成する。基底細胞は通常、100〜2,000細胞/80°Lの濃度でめっきされ、一方、発光細胞は通常2,000〜10,000細胞/80°Lの濃度でめっきされる。めっきされた細胞の密度は、予想される材料収集の日、および所望の下流用途によって異なります。注:マスターミックス調製の前に、予想されるマスターミックスボリューム5分のために適切なサイズのチューブを冷やします。マトリックスゲルが取り扱い中に硬化しないようにするには、マトリックスゲルを新しいチューブに移す前に3~4回ピペットチップをピペットで冷やしておく必要があります。 24ウェルプレートのウェルあたり80°Lのマトリックスゲル/セル混合物を加えます。ポリHEMAコーティングとの直接接触を避けながら、井戸の壁の下半分に液滴を配管することをお勧めします。マトリックスゲルを加えた後、プレートを旋回してマトリックスゲル/セル混合物がウェルの縁の周りに環を形成できるようにします。 24ウェルプレートを37°C 5%CO2インキュベーターの右側に10分間上に置き、マトリックスゲルが部分的に硬化できるようにします。注:インキュベーターに24ウェルプレートを入れてすぐ37°Cでマウスオルガノイドメディアの温めを開始します。 10分間インキュベートした後、24ウェルプレートを逆さまに反転し、さらに50分間インキュベートしてマトリックスゲルを完全に硬化させます。 350 μL の事前温めマウス オルガノイド メディアを各ウェルの中心にドロップワイズして追加します。注:マトリックスゲルの完全性を維持するためには、媒体を加えながらマトリックスゲルリングを避けるのが重要である。 メディアを加えた後、24ウェルプレートを37°C 5%CO2インキュベーターに戻します。 3. マウスオルガノイドメディアの補充 — タイミング: 10-15 分/24ウェルプレート 注:既存のメディアは、48 時間ごとに新しいメディアに置き換える必要があります。各メディアが変化する前に、事前に暖かいマウスオルガノイドメディア。補充に使用する媒体にROCK阻害剤を添加する必要はない。 24ウェルプレートを45°の角度で傾け、マトリックスゲルリングを避けながら、p1000ピペットを使用して各ウェルの中心から既存のメディアをゆっくりと取り外します。 ステップ2.9のように、350 μLの事前温めマウスオルガノイドメディアを追加します。主要な栄養素と成長因子の急速な枯渇を防ぐために、5日以上培養したオルガノイドに大量の媒体(最大1mL)を加えることをお勧めします。 4. ウェスタンブロット分析のための前立腺オルガノイドからのタンパク質溶解物の抽出 — タイミング: 2.5-4 H 注:タンパク質リサート抽出のためのオルガノイドを収集する前に、調製および事前温かいディスパーゼ含有媒体(表1)。 手順 3.1 と同様に、各メディアからメディアを取り外します。 オルガノイドを収集するには、1mLのディスパーゼ含有媒体を直接マトリックスゲルリングにピネリングしてマトリックスゲルを繰り返しブラストし、リング全体が外れるまでマトリックスゲルリングに移し、1.5mLマイクロ遠心管に移す。注:ポリHEMAコーティングされた井戸との直接接触を避けることは重要です。直接接触すると、Poly-HEMAによる収集された材料の汚染を引き起こし、細胞の生存に悪影響を及ぼす可能性があります。 1.5 mLマイクロ遠心管を37°C5%CO2インキュベーターに30分間1時間置き、マトリックスゲルをディスパゼで完全に消化できるようにします。 ペレットオルガノイドはRTで5分間800 x gで遠心分離し、マイクロピペットを用いて上清を除去する。 リン酸緩衝生理食塩糸(PBS)をオルガノイドペレットに加え、軽くフリックして再サスペンドします。注:オルガノイドペレットを十分に再中断しないと、残留ディスパーゼまたはマトリックスゲルを有するオルガノイド物質の汚染をもたらし得る。 RTで5分間800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、マイクロピペットを使用して上清を除去する。 各チューブをドライアイスとメタノールを含む溶液に入れてオルガノイドペレットを速く凍結します。将来の使用が-80°Cになるまでチューブを保管してください。あるいは、ステップ4.6の直後にタンパク質リサートを抽出する。 オルガロイドペレットを100μLのタンパク質リシス緩衝液(表1)で、パックされた細胞体積10μLあたり再分散させる。フリックして再サスペンドします。注:速凍結後に再開する場合は、リンスファターゼおよびプロテアーゼ活性を防ぐために、リシスバッファーを直ちにサンプルに添加する必要があるため、-80°Cからサンプルを除去する前にタンパク質リシスバッファーを解凍してください。 少なくとも45分間氷上のタンパク質リシスバッファー内のサンプルをインキュベートする。注:核タンパク質回収の効率を高めるために、氷上でインキュベーションする前に超音波処理することをお勧めします。しかし、超音波処理は必要ありません。超音波処理が行われない場合は、ステップ 4.10 に進みます。 超音波処理するには、湿った氷の中にチューブを沈め、静かにマイクロ遠心管の外側にソニックディスムブラタの先端を適用します。20 kHzで40 sの超音波処理。 確立されたプロトコルに従ってウェスタンブロットに進みます。 5. 全実装共焦点顕微鏡による免疫組織化学分析のための前立腺オルガノイドの固定と染色 24ウェルプレートから前立腺オルガノイドを収集 — タイミング:45-60分注:共焦点顕微鏡のために処理する前立腺オルガノイドを収集する場合、その構造を維持するために注意してそれらを処理することが重要です。以下の収集プロトコルは、単離時のオルガノイド構造の破壊を低減するように設計されています。 手順 3.1 と同様に、各メディアからメディアを取り外します。 マトリックスゲルを消化し、500μLのディスパーゼ含有媒体(表1)を37°C 5%CO2インキュベーターで30分間インキュベートします。 消化されたオルガノイド懸濁液をマイクロ遠心管に集め、RTで3分間800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレット化します。 前立腺オルガノイドの全実装免疫蛍光染色 — タイミング: 3-4日 (1-5 時間/日) PBSに4%パラホルムアルデヒドの500 μLを加え、穏やかな振るみでRTで2時間インキュベートします。 RTで800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、上清を取り除き、1mLのPBSでペレットを1mLのPBSで15分間穏やかに振る。 ステップ5.2.2のようにペレットを2回洗います。 RTで3分間800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、上清を除去する。ブロッキングソリューションに1μg/mL DAPIを追加します(表1)。RTで2時間、または4°Cで穏やかな振とうで一晩インキュベートする。 RTで3分間800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、上清を除去する。一次抗体(ウサギ抗p63、マウス抗サイトケラチン8)をブロッキング溶液に添加し、穏やかな振とうで4°Cで一晩インキュベートする。 RTで3分間800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、上清を除去する。穏やかな振り振りで15分間PBSの1 mLでペレットを洗浄します。 ステップ5.2.6のようにペレットを2回洗います。 RTで3分間800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、上清を除去する。二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG-Alexa Fluor 594、ヤギ抗マウスIgG-Alexa Fluor 488)をブロッキング溶液に添加し、穏やかな振とうで4°Cで一晩インキュベートする。 RTで800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、上清を取り除き、1mLのPBSでペレットを1mLのPBSで15分間穏やかに振る。 ステップ5.2.9のようにペレットを2回洗います。 6. 全実装共焦点顕微鏡用染色前立腺オルガノイドの組織開失と取り付け — TIMING: 7 H RTで3分間800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、上清を除去する。 1%トリトンX-100でPBSに30%スクロースの1 mLを追加し、穏やかな振り振りでRTで2時間インキュベートします。 RTで3分間800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、上清を除去する。 1%トリトンX-100でPBSに45%スクロースの1 mLを追加し、穏やかな振り振りでRTで2時間インキュベートします。 RTで3分間800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、上清を除去する。 1%トリトンX-100でPBSに60%スクロースの1 mLを追加し、穏やかな振り振りでRTで2時間インキュベートします。 RTで3分間800 x gで遠心分離してオルガノイドをペレットし、上清の95%を除去する。注:スクロースの濃度が高くなるにつれてペレットが緩くなる。UV光の下でDAPI染色オルガノイドを観察し、上清の除去中に失われていなかったことを確認することをお勧めします。 残りの懸濁液の10~20°Lの液滴をチャンバ入カバースリップに移し、共焦点顕微鏡に進みます。注:カバースリップフラグメントは、スペーサーとして使用する液滴の両側に配置できます(図4C)。これらは、カバースリップが液滴の上に置かれたときにオルガノイドが崩壊するのを防ぎます。