تقييم قدره التمايز من الخلايا الظهاريه البروستاتا الماوس باستخدام الثقافة Organoid
Summary
الفئران البروستاتا العضوية تمثل سياق واعده لتقييم أليات التي تنظم التمايز. تصف هذه الورقة نهجا محسنا لإنشاء organoids البروستاتا ، ويقدم أساليب ل (1) جمع البروتين محلله من organoids ، و (2) الإصلاح والهيكل التنظيمي وصمه عار لكامل جبل المجهر البؤري.
Abstract
وتتالف ظهاره البروستاتا في الغالب من الخلايا القاعدية والاناره. وقد استخدمت في تتبع سلاله الجسم الحي لتحديد قدره التمايز من الخلايا القاعدية البروستاتا الماوس والاناره خلال التنمية ، وتجديد الانسجه والتحول. ومع ذلك ، تقييم الخلايا الذاتية والمنظمين خارج البروستاتا من قدره التمايز الظهاريه البروستات باستخدام نهج تتبع النسب غالبا ما يتطلب تربيه واسعه النطاق ويمكن ان تكون باهظه التكلفة. في فحص organoid البروستاتا ، خلايا القاعدية والتلالؤ توليد ظهاره البروستاتا السابق الجسم الحي. الأهم من ذلك ، يمكن عزل الخلايا الظهاريه الاوليه من الفئران من اي خلفيه وراثيه أو الفئران التعامل مع اي عدد من الجزيئات الصغيرة قبل ، أو بعد ، والطلاء في الثقافة ثلاثية الابعاد (3D). وتنشا مواد كافيه لتقييم قدره التمايز بعد 7-10 يوما. مجموعه من المشتقات القاعدية والمستمدة من التلالؤ لتحليل البروتين بواسطة لطخه الغربية و (2) تحليل مناعي العضوية السليمة من قبل المجهر الكامل جبل المحورية تمكن الباحثين لتقييم التمايز الجسم الحي السابق قدره الخلايا الظهاريه البروستاتا. عندما تستخدم في تركيبه, هذه النهجين توفر معلومات تكميليه حول قدره التمايز من خلايا البروستاتا القاعدية والاناره استجابه للتلاعب الوراثية أو الدوائية.
Introduction
تتكون الخلايا القاعدية والتلالؤه من غالبيه ظهاره البروستاتا1. وقد كشفت دراسات تتبع النسب ان هذه الأنواع من الخلايا هي في الغالب مكتفيه ذاتيا من قبل الأسلاف متميزة في الماوس الكبار2; ومع ذلك, وقد لوحظ التمايز التلالؤ من الأسلاف القاعدية في عده سياقات بما في ذلك التنمية3,4, تجديد الانسجه5, التهاب6,7 وبدء سرطان البروستاتا2,8. وعلاوة علي ذلك ، تدعم البيانات الناشئة وجود المولدين المضيئين متعددي القوي وكذلك الأسلاف الملتزمين بالاناره9. في سرطان البروستاتا المنتشر ، والتمايز من سلاله الاناره التابعة لل AR إلى النسب غير مبال مع القاعدية وميزات الغدد الصماء يمثل اليه التقدير علي نحو متزايد من المقاومة لمثبطات المسار الاندروجين10،11،12. ولذلك ، كما هو متورط في التمايز الفسيولوجية الطبيعية ، والشروع في السرطان والمقاومة للعلاج ، توضيح المنظمين الجزيئية الرئيسية للتمييز الخلايا الظهاريه البروستاتا أمر بالغ الاهميه.
ظهر نموذج organoid البروستاتا الماوس كسياق السابقة الجسم الخارجي انيقه لدراسة البروستاتا الظهاريه التمايز الخلية9,13,14. في هذا الفحص ، يتم طلاء الخلايا الظهاريه الفردية في مصفوفة 3D حيث انها تولد الهياكل الغديه التي تحتوي علي كل من الخلايا القاعدية والاناره في غضون 1 أسبوع. في حين يمكن استخدام النهج القائمة لطلاء الخلايا في الثقافة العضوية لتوليد بكفاءة العضوية العضوية ، وهذه النهج تتطلب المزيد من التحسين14. وتشمل التحديات البارزة المرتبطة بزراعه البروستاتا العضوية (1) باستثناء المستعمرات ثنائيه الابعاد (2D) التي تشكل تحت الحاكم (مصفوفة هلام) من التحليل ، (2) الحفاظ علي سلامه هلام مصفوفة خلال التغييرات وسائل الاعلام ، و (3) العد العضوي بدقه. هذه الورقة الخطوط العريضة لنهج لتوليد العضوية من الخلايا الظهاريه معزولة من البروستاتا الماوس. النهج الموصوف ينطوي علي لوحات الطلاء مع بولي (2-هيدروكسي ايثيل ميثاكريلات) (بولي هيما) لمنع حدوث مستعمرات 2D. وعلاوة علي ذلك ، يتم طلاء الخلايا في حلقه هلام مصفوفة ، بدلا من قرص هلام مصفوفة ، مما يجعل تغيير وسائل الاعلام والعد organoids اقل تحديا. تسمح هذه التقنيات للباحثين بالتحقيق بسهوله أكبر في كيفيه تغير التغيرات الجينية أو الجزيئات الصغيرة التي تم إدخالها قبل أو اثناء التشكيل العضوي الذي يغير العمليات الرئيسية مثل التمايز.
حصاد البروستاتا العضوية للطخه الغربية أو تحليل مناعي من قبل المجهر البؤري الكامل جبل يمكن ان توفر البصيرة الميكانيكية قيمه في التمايز13، ولكن البروتوكولات الراسخة لاعداد العضوية لهذه التقنيات تفتقر. تصف هذه المخطوطة النهج المتبعة في حصاد العضو العضوي (1) لجمع البروتين ، أو (2) التثبيت وتلطيخ المجهر البؤري. الأهم من ذلك ، تم تحسين النهج الموصوف لتحديد وتلطيخ organoids البروستاتا إلى حد كبير فيما يتعلق بالأساليب القائمة. وفي حين تعتمد هذه الطريقة علي الهيكل العضوي15، فان الأسلوب الموصوف في هذه المخطوطة يستخدم الهيكل العضوي السليم ، الذي يساعد علي الحماية من التلف العضوي اثناء اعداد العينة. عندما تستخدم في تركيبه ، وصمه عار الغربية والمجهر البؤري يمكن ان توفر نظره قيمه في المنظمين الجزيئية من التمايز. وبدلا من ذلك ، يمكن استخدام هذه النهج لنمذجة عمليات أخرى مثل التنمية والتحول.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تورط البروستاتا الظهاريه التمايز الخلية في كل من البيولوجيا البروستاتا العادية2,3,4,5,6,7 والبيولوجيا المرض8,10,11,12; ومع ذلك ، يبقي المنظمون الرئيسيون لهذه العملية غير معرف. وقد كان من الصعب تحديد الجهات التنظيمية الرئيسية لتمايز الخلايا الظهاريه البروستاتا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود سياقات راسخة لنمذجة ذلك. في حين يمكن استخدام 2d الثقافة أحاديه الطبقة لنموذج التمايز11,12, فشل هذا السياق لتلخيص البيئة المجهرية البروستاتا المعقدة. وعلاوة علي ذلك ، في السياقات المجرية إلى التمايز النموذجي لا تصلح للدراسات الميكانيكية ، لأنها تشكل تحديا للتلاعب. ولذلك ، فان تحديد السياق الذي يسهل التلاعب به ، وان كان مناسبا من الناحية الفسيولوجية ، لدراسة التمايز أمر بالغ الاهميه.
نموذج organoid البروستاتا يمثل سياق الجسم الحي السابق انيقه حيث يتم الإبلاغ عن القاعدية إلى التمايز التلالؤ تحدث. طرق لإنشاء البروستاتا العضوية راسخة14؛ ومع ذلك ، من الضروري زيادة تحسين هذه الأساليب. وعلاوة علي ذلك ، لا توصف بوضوح النهج المتبعة لحصاد واعداد الأرغن البروستاتا للتحليل. تصف هذه الورقة نهجا للخلايا البروستاتا الظهاريه الخلايا المعزولة من البروستاتا الماوس إلى ثقافة organoid. هذا النهج يسمح للباحثين ل (1) منع حدوث المستعمرات 2D خلال تشكيل organoid ، (2) الحد من خطر تعطيل هلام مصفوفة خلال تجديد وسائل الاعلام ، و (3) العد العضوي أكثر فعاليه. الاضافه إلى ذلك ، توجز هذه المخطوطة النهج المتبعة لحصاد الهيكل العضوي للتحضير للتحليل الغربي للطخه ، أو المجهر البؤري الكامل الذي يعلو الجبل. الأهم من ذلك ، فان النهج المستخدم لاعداد العضوية للمجهر البؤري يحافظ علي البنية السليمة من الهيكل العضوي خلال مدته ، مما يقلل من الضرر العضوي قبل اكتساب الصورة. تماما ، والنهج الموصوفة توسيع قدرات الفحص organoid البروستاتا.
وعلي وجه الخصوص ، يمكن تغيير القدرة العضوية المكونة للخلايا القاعدية وخلايا الاناره علي حد سواء من خلال الطرق المستخدمة لعزل السكان المعنيين ، وبحسب الظروف الثقافية. وصفت الظروف الثقافية العضوية المستخدمة في هذا الفحص لأول مره من قبل Karthaus et al.13. في حين ان Karthaus et al. وقد ذكرت ان الخلايا القاعدية لديها اعلي العضوية تشكيل القدرة (15 ٪) من خلايا الاناره (1 ٪)13، chua et al. ، باستخدام أساليب العزلة المتميزة والظروف الثقافية ، وأفادت ان خلايا الاناره (0.2-0.3 ٪) لديها قدره اعلي تشكيل العضوية من الخلايا القاعدية (0.03 ٪)20. وعموما ، فان الطرق الموصوفة من قبل Karthaus et al. تؤدي إلى ارتفاع معدلات التشكيل العضوي للخلايا القاعدية وخلايا الاناره ، مما يعكس علي الأرجح الاختلافات في النهج المستخدم لعزل الخلايا القاعدية والاناره13، بدلا من الظروف الثقافية التي تحيز ضد التشكيل العضوي ولا يزال من غير الواضح ما إذا كان البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة يفضل تشكيل الهيكل العضوي من المولدات المضيءه متعددة الفعاليات ، أو الملتزمين-المولدين اللامعين9. علي الرغم من ان في الوقت المناسب وباهظه التكلفة ، في الكائنات المجرية تتبع الدراسات يمكن استخدامها للتحقق من الميزات سلف المرتبطة بسلالات الظهاريه البروستاتا واضحة في الفحص organoid.
عمليات مثل التنمية والتمايز والتحول ليست فقط ذات الصلة بعلم الاحياء البروستاتا ، ولكن أيضا ذات الصلة بعلم الاحياء من الانسجه الأخرى بما في ذلك الدماغ والرئة والأمعاء والبنكرياس والكبد. الأساليب الموصوفة تسهل استخدام النموذج العضوي لدراسة هذه العمليات ليس فقط في البروستاتا ، ولكن أيضا مجموعه واسعه من الانسجه.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم PDC و JMG من قبل روث ل. كيرششتاين جائزه خدمه البحوث الوطنية GM007185. ويدعم جاد من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية للصحة (R25GM055052) الممنوحة ل t. هالان ومنحه شاول مارتينيز. ويدعم صندوق مؤسسه سبيتزر للاسره وهبه جيل الأمين المساعد. وقد دعم هذا العمل من قبل جمعيه السرطان الامريكيه (RSG-17-068-01-TBG), وزاره الدفاع (W81XWH-13-1-0470), مارغريت ه. البحوث الطبية المبكرة الثقة, المعاهد القومية للصحة/انجي (P50CA092131/كاليفورنيا بوغ في سرطان البروستاتا), روز هيلز المؤسسة, ودعم من جامعه كاليفورنيا جونسون مركز السرطان الشامل, مركز أبحاث الخلايا الجذعية واسعه, معهد العلوم السريرية والانتقالية, ومعهد علم الأورام البولي.
Materials
| µ-Dish 35mm, high | ibidi | 81156 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 ug | BioLegend | 118218 | |
| B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
| (DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
| Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
| FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 102405 | |
| FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 103107 | |
| FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 116205 | |
| Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
| Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
| Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
| Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
| PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
| Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |
References
- Kwon, O. J., Xin, L. Prostate epithelial stem and progenitor cells. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 2 (3), 209-218 (2014).
- Choi, N., Zhang, B., Zhang, L., Ittmann, M., Xin, L. Adult Murine Prostate Basal and Luminal Cells Are Self-Sustained Lineages that Can Both Serve as Targets for Prostate Cancer Initiation. Cancer Cell. 21 (2), 253-265 (2012).
- Ousset, M., Van Keymeulen, A., et al. Multipotent and unipotent progenitors contribute to prostate postnatal development. Nature Cell Biology. 14 (11), 1131-1138 (2012).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 1-13 (2014).
- Wang, Z. A., Mitrofanova, A., et al. Lineage analysis of basal epithelial cells reveals their unexpected plasticity and supports a cell-of-origin model for prostate cancer heterogeneity. Nature Cell Biology. 15 (3), 274-283 (2013).
- Kwon, O. J., Zhang, B., Zhang, L., Xin, L. High fat diet promotes prostatic basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate epithelial hyperplasia originated from basal cells. Stem Cell Research. 16 (3), 682-691 (2016).
- Kwon, O. J., Zhang, L., Ittmann, M. M., Xin, L. Prostatic inflammation enhances basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate cancer with a basal cell origin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 192 (3), 997-999 (2014).
- Stoyanova, T., et al. Prostate cancer originating in basal cells progresses to adenocarcinoma propagated by luminal-like cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (50), 20111-20116 (2013).
- Agarwal, S., Hynes, P. G., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Bishop, J. L., et al. The Master Neural Transcription Factor BRN2 Is an Androgen Receptor-Suppressed Driver of Neuroendocrine Differentiation in Prostate Cancer. Cancer Discovery. 7 (1), 54-71 (2016).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Drost, J., Karthaus, W. R., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), e59051 (2019).
- Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 181-186 (2007).
- Chen, H. Y., Kaya, K. D., Dong, L., Swaroop, A. Three-dimensional retinal organoids from mouse pluripotent stem cells mimic in vivo development with enhanced stratification and rod photoreceptor differentiation. Molecular vision. 22, 1077-1094 (2016).
- Liu, X., et al. Low CD38 Identifies Progenitor-like Inflammation-Associated Luminal Cells that Can Initiate Human Prostate Cancer and Predict Poor Outcome. Cell Reports. 17 (10), 2596-2606 (2016).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Chua, C. W., Shibata, M., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
