周波数領域ベースのカメラシステムを用いた_O2の発光寿命イメージング

1. 平面O2光大脱の製造 発光O2指標染料白金(II)-5,10,15,20-テトラキス-(2,3,4,5,6-ペンタフルオルフェニル)-ポルフィリン(PtTFPP)と100mgのポリスチレン(PS)をクロロホルム1gに溶解し、いわゆる「カクテルセンサー」を得る。注:カクテルは、さらに使用するまで冷蔵庫と暗闇の中で数時間、閉じたガスタイトなガラスバイアルに保管することができます。 水またはエタノールの助けを借りて、洗浄されたガラス板に清潔でほこりのないポリエチレンテレフタレート(PET)箔(用途に依存するサイズ)を固定します(70%)フィルム (図 1A) 洗浄されたナイフコーティング装置(120μm)をホイルの上に置き、ガラスピペットを使用してデバイスの前面にセンサーカクテルのラインを適用します(図1B)。次に、ナイフコーティング装置をゆっくりと均一にPET箔の上にドラッグし、カクテルを均等に広げます。メモ:すべての材料とツールを徹底的に洗浄する必要があり、製造は、ヒュームフード、フローベンチ、またはポイント吸引装置の下など、ほこりのない環境で行う必要があります。最終的なセンサー箔の不均一性を避けるために、クロロホルムが速く蒸発するので、箔へのセンサーカクテルの適用に続くステップは迅速に行われるべきです。 完成した平面O2感受性光大灯を周囲の空気に1時間乾燥させ、その後50〜60°Cの加熱キャビネットで夜間に乾燥させ、溶媒蒸発後の最終層厚さ~12μmの結果、生成したオプトードを暗闇(例えば紙封筒)に入れて、さらに使用するまで乾燥させる(図1C)。注:平面O2オプトードは、使用前に数ヶ月から数年の間、乾燥した暗闇の中で保存することができます。1-20 μmの範囲の最終的な層の厚さは十分な発光信号および十分な応答時間と良好な結果を提供することが証明された。 2. ライゾサンドイッチチャンバー 2枚のガラス板(24.5 x 14 cm2、厚さ:4mm)を96%エタノールで清掃します。 1 つの長いエッジを開いたまま、最初のガラス板のエッジ (76 x 26 mm2、厚さ: 1 mm) に沿って顕微鏡スライド (76 x 26 mm 2 、 厚さ : 1 mm) を接着するには、光硬化性のアクリルベースのインスタント接着剤 (材料表を参照) を使用します。必要に応じて、ガラスカッターを使用して顕微鏡スライドを短くします。注意:ガラスを切断すると、鋭いエッジを引き起こす可能性があり、注意して取り扱う必要があります。注:顕微鏡スライドは、前面と背面の間のスペーサーとして機能し、根の厚さと植物の大きさに応じて、顕微鏡スライドの複数の層を互いに接着することができます。 接着された顕微鏡スライドの間のスペースに収まるように、平面のオプトードを必要な形状とサイズにカットします。コーティングされた側面を上向きに前面ガラス板の内側に置き、押し付けたときに目的のサンプルと接触できるようにします。 光箔の片端をガラス板にテープで貼り付け、ガラス板と光大管の間に数滴の水道水を加えます(図2A)。これらの水滴のホイルをゆっくりと下げて、ガラス表面にそれをまっすぐにします。 センサーコーティングの傷を避けながら、柔らかいティッシュを使用して平面のオプトードとガラス板の間に閉じ込められた気泡を慎重に取り除きます。ガラス板を乾かし、光箔の残りの端をガラス板にテープで留めます(図2B)。注:水中で適切な接着性を持つテープを選択する必要があります。 メッシュサイズ0.5mmを使用して堆積物をふるいにかけます。最初のガラス板に湿った堆積物のスプーンを置きます(図2C)。注: メッシュ サイズは、スペーサーの厚さの半分より大きくしないでください。 堆積物を均等に分配し、平らなガラス板を使用して顕微鏡スライドスペーサーと同じ厚さに調整します。顕微鏡スライドの上面を慎重に清掃し、2番目のガラス板がチャンバーを正しくシールするようにします。 顕微鏡スライド表面にシリコングリースを塗布します。気泡の形成を慎重に避けながら、薄い水膜で堆積物をカバーします。 リトレラ・ウニフローラの1回の撮影を慎重に洗浄し、上側の開いた側から植物の葉を突き出して、堆積物の上に置きます(図2D)。 2つ目のガラス板を、オプトードを付けた場所に置き、堆積物の上に穏やかな圧力をかけて、植物の根や周囲の堆積物に密着して光を持たせます。注:堆積物に閉じ込められた気泡は、ガラス板を傾けながら一緒に取り除くことができます。 クランプを使用してガラスプレートを一緒に固定します(図2E)。外側の端をティッシュペーパーで乾かします。根茎サンドイッチの組み立て全体を通して葉を保湿してください(例えば、数滴の水を頻繁に添加することによって)。 ビニール電気テープを使用して根茎サンドイッチチャンバーを締めます。モデリング粘土でエッジを密封し、さらにビニール電気テープでテープを貼ります(図2F)。注:堆積物に多くの気泡がある場合、またはスペーサー顕微鏡スライドと第2ガラス板の間に堆積物の粒がある場合は、細孔水が漏れる可能性があるのでチャンバーを再構成する必要があります(手順2.4~2.8を繰り返します)。 根茎サンドイッチをカバーするために不透明なプラスチックを使用しますが、植物の葉が突き出るためにホイルにスリットを残します。プラスチック箔で窓を切り、展開することで実験用に開きます。ゴムバンド(図2G)を使用して順応時にウィンドウを閉じ、植物がインキュベートされている間に光の漂白から光を保護します。注:藻類の成長は、測定されたO2濃度を妨げる可能性がありますので、濾過水、事前に洗浄された実験装置を使用し、形成時に藻類を除去することによって、それを最小限に抑えることをお勧めします。 3. ライゾサンドイッチチャンバーインキュベーション 水槽(32 x 7 x 28 cm3)に根茎サンドイッチチャンバーをわずかに傾けた位置に置き、平面のオプトデに対する根の成長を促します。 植物の葉を完全に水没させるのに十分な水で水タンクを満たします。 時間制御ランプを使用して植物の順応のための14時間の光、10時間の暗いサイクルを確立する。空気石または水ポンプをタンクに入れ、水の通気と混合を確実にします(図2H)。 4. イメージング イメージングの設定 根茎サンドイッチ室の平面光を覆うプラスチック箔を取り外します。水族館の壁に直立した光を持つガラスの壁でチャンバーを配置します。スペーサーを使用して、水族館の壁に根茎サンドイッチ室を押します。注:水族館の壁の全体的な厚さと根茎サンドイッチ室の壁はあまり厚くなりませんが、散乱光の減衰を増加させることによって空間的なクロストークを減らすために、発光イメージングのための水族館の壁のためのガラスの厚さは>1 cmで推奨されます。材料界面での光散乱を最小限に抑えるためには、両方のガラス壁に同じ材料(同じ耐火性インデックス)を使用することが重要です。これは同様にぼやけた画像につながるように12. 水族館の前に目的を搭載した周波数領域ベースの発光寿命カメラを配置し(材料表を参照)、目的の領域(平面光葉と直接接触する水生植物リトレラユニフローラの根)を配置します(図3)。メモ:カメラの高さを簡単に調整できるように、カメラをラボスタンドに置く場合があります。ラボスタンドの位置をマークし、固定しておく必要があります。さらに、実験中にカメラが誤って動かないように、カメラをラボスタンドにテーピングできます。 カメラの目的でPtTFPPを指標染料としてイメージングするための適切な発光フィルタをねじ込み(材料表を参照)、励起源から推論を除去します。メモ:スクリューオンフィルタは理想的ですが、正方形フィルタは適切なアダプタで使用することも、目的に合わせて慎重にテーピングして使用することもできます。 LED 励起ソース(マテリアルの表を参照)をカメラの変調および暗いゲート出力に接続します。メモ:前者は光源の変調信号を提供し、後者はイメージセンサの画像読み出し中にライトをオフに切り替えます。LED励起ソースとカメラをコンピュータに接続します。背景ライトは、部屋全体を暗くするか、設定全体の上に密な黒い布を置くことによって、画像の読み出し中に最小化する必要があります。後者の場合、カメラの加熱を避けるために十分な換気を確保することが重要です。 LED励起源のライトガイドを固定し、対象領域をカバーする平面光箔を均等に照らすために配置します。注:使用されるLED励起源では、3つの異なるLED(460 nm、528 nm、625 nm)を切り替えることができますが、その強度は制御ソフトウェアを介して調整することができます。 設定とカメラ操作注: 前述の実験では、市販のソフトウェア パッケージで生涯イメージング用の専用モジュールと組み合わせて周波数ドメイン ベースの有効期間カメラを使用しました (材料表を参照)。 使用する前に、選択したソフトウェアでカメラを選択します。メモ:ソフトウェアとカメラのドライバは、製造元のガイドラインに従ってイメージングする前にインストールする必要があります。 LED制御ソフトウェア(実験開始前に再びインストール)を開き、スタンバイをオフにして適切なLED(ここでは528 nm)を選択します。必要に応じて LED 強度を設定します(ここでは 30%)。LED が外部 TTL によってトリガーされていることを確認します。これは、LEDのアナログと同期をチェックすることによって行われます。注:レーザーパワーが高すぎると、インジケーターまたは基準染料の光白化が加速される可能性があるため、LED強度を個別に調整する必要があります。 カメラに焦点を合わせ、目的の絞りを手動で調整します(本研究ではf = 2.8を使用)。注:水族館のガラスではなく、平面のオプトードにカメラを焦点を当てることが重要です。これは、スケールの定規で画像を撮影し、実際のルーラーではなく、オプトード上の定規の影に焦点を当てることによって保証することができます。 ソフトウェアのカメラコントロールパネル内で次のパラメータを設定します: 内部変調ソース。出力波形の正分波;追加の位相サンプリング(はい)。8相サンプル、位相順序反対、タップA + B読み出し。5 kHzの変調周波数。注: これらのパラメータは画質に影響し、必要に応じて変更できます。カメラの製造元は、個々のパラメータに関するガイドラインを提供します (カメラの製造元は、ソフトウェアが更新されるたびにガイドラインと更新プログラムをリリースしています)。 実験の前に参照画像を撮ります。注:これは、キャリブレーション標準(既知の寿命(nsまたはμs)を持つ発光色素)をイメージングするか、LEDの反射光を使用して行うことができます。後者の場合、放出ロングパスフィルタを目的から削除する必要があり、既知の有効期間を1nsに設定できます。 正規化された発光強度イメージのROI統計読み出し(このパネルの下部)が0.68~0.72の範囲になるまで、専用イメージングソフトウェアのキャリブレーションセクションの露光時間を調整します。メモ:参照の有効期間(例えば、1 ns)がソフトウェアへの入力として与えられます。 [キャプチャ参照]を押して、基準測定シリーズの取得を開始します。注:完了すると、参照データが保存され、サンプルに対して単一または時間経過の測定を行うことができます。 O2光大解のキャリブレーション (小さな)ガラスの水族館に平らなO2感受性の光大脱片の部分を置きます。前に説明したように、キャリブレーションチャンバーのガラス壁に平面光を固定します(セクション2.3を参照)。キャリブレーション水族館をカメラの前に置きます。LEDによる照明と、光大管の視野全体を塗りつぶすようにします。注:平面のオプトデは、同じ箔から、または実際の実験で使用される箔と同じセンサーカクテルから作られるべきです。 実験で使用したのと同じ液体媒体で水族館を埋めます。メモ:キャリブレーションや実験に異なるメディアを使用すると、測定に影響を与える可能性があります(例えば、センサ応答および/またはO2溶解度を変更することによって)。したがって、キャリブレーションは、実際の実験と同じ媒体と同じ温度で行う必要があります。温度の変動は発光信号に影響を与え、避けるべきです。ただし、温度を安定させることができない場合は、O2-sensitive オプトード(複数点)を異なる(関連する)温度でキャリブレーションし、その後の値の再計算を行うことで、温度補償を行う必要があります。 ガス混合装置を使用して、既知のO2濃度の空気/N2ガス混合物で水を洗い流すことによって、キャリブレーション水族館内のO2濃度を調整します。十分な時間をエー調することによって、水が使用されるガス混合物と十分に平衡化されていることを確認します(水族館の流量と大きさによって異なります)。注:キャリブレーション水族館のO2レベルを温度補償(光ファイバまたは電気化学O2センサを使用)で監視することをお勧めします。 キャリブレーション室内の異なるO2濃度で一連の画像を撮ります。注:取得したキャリブレーションデータに適切なカーブフィットを可能にするには、少なくとも5つの異なるO2濃度を測定する必要があります。0 hPa (アノキシック条件) で測定し、その他の値を特定の指標色素のダイナミックレンジに分散することが重要です。ここでは、ポリスチレンマトリックスに固定化されたO2感受性指標色素としてPtTFPPを用いた。画像は 0、48、102、156、および 207 hPa で撮影されました。207 hPaは、与えられた白色度および圧力で100%空気飽和に対応する。 サンプルのイメージング カメラの前面にサンプルを置き、照明も確認します。 プラントの発光寿命画像を取得する直前に、プラント(および他のすべての光源)への光供給照射をオフにします。強度画像に基づいて集録時間を調整し、信号が過飽和でも弱くもなく、寿命決定においてノイズ(S/N)比に対して良好な信号を得られるようにします。 様々な光条件(例えば、明るい/暗い)に植物を露出させ、画像のセットを取得します。 部屋のライトをオンにして構造画像を取得します。注:背景ライトをオンにすると、カメラは現実的な寿命画像を測定しません。ただし、強度イメージは、半透明のオプトデを通して見た視野全体を示すようになりました。 取得した画像の後のスケーリングを可能にするために、視野内の定規などで画像を撮ります。 5. データ分析 カメラの製造元が提供するマクロを使用して、専用のイメージング ソフトウェアからフェーズの有効期間と強度のイメージを直接エクスポートします。 自由に利用できる画像解析ソフトウェアを使用して、さらに画像解析を実行します(材料表を参照)。 画像解析ソフトウェアでキャリブレーションの位相寿命画像を開き、計測機能を使用して画像全体の平均を決定します。測定された寿命を既知のO2濃度に対してプロットし、キャリブレーション機能を決定します(図4A)。 すべてのデータからƒ0/ƒを計算します(ƒ0は O2がない場合の測定された位相の有効期間です)。これらの値と既知のO2濃度をプロットする(図4B)。 動的衝突焼入れ用の簡略化された2部位モデル(式3)38、39(Q]がO2濃度)を用いて、キャリブレーションプロットからパラメータKsvとfを求める。データ解析ソフトウェアで適合関数を定義し、Ksvと f を決定します。 (3) 画像解析ソフトウェアで取得したサンプル画像を開き、決定されたパラメータKsv、fおよびε0を使用して、画像化された寿命をO2濃度に変換する。メモ:代替アプローチとして、取得したキャリブレーション位相寿命値(図4A)も直接使用できます。この場合、カーブフィット関数を使用した指数適合がキャリブレーションに使用されます。 画像解析ソフトウェアで次の定規で画像を開き、測定ツールを使用して既知の距離を測定します。[スケールの設定] の下に、この測定値をグローバル スケールとして設定します。