Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması
Summary
Bu yöntem, kültürhücreleri ve hayvan dokularından örnek hazırlanmasını, örneklerde koenzim A’nın çıkarılması nı ve türebenizasyonunu, türevleştirilmiş koenzim A’nın saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için yüksek basınçlı sıvı kromatografisi absorbans veya floresan algılama.
Abstract
Ortaya çıkan araştırmalar hücresel koenzim A (CoA) kaynağı büyüme, metabolizma ve sağkalım üzerinde zararlı bir etkisi ile sınırlayıcı hale gelebileceğini ortaya koymuştur. Hücresel CoA ölçümü nispeten düşük bolluk ve coa thioesters için ücretsiz CoA dinamik dönüşüm nedeniyle bir meydan okuma, sırayla, çok sayıda metabolik reaksiyonlar katılmak. Bir yöntem, numune hazırlama sırasında birçok biyomedikal laboratuvarda kullanıma uygun geniş bir doğrusal algılama aralığıile bir test verim potansiyel tuzaklar arasında gezinir açıklanmıştır.
Introduction
Koenzim A (CoA) tüm canlıorganizmalarda önemli bir kofaktördür ve pantotenik asitten sentezlenir, pantotenat (pantotenik asit tuzu) veya B5 vitamini olarak da adlandırılır. CoA organik asitlerin büyük hücre içi taşıyıcısıdır, asetat ve sinkinat gibi kısa zincirli asitler, propiyonat ve metimalonat gibi dal zincirli asitler, palmitat ve oleat gibi uzun zincirli yağ asitleri, çok uzun zincirli yağ asitleri gibi çoklu doymamış yağ asitleri, ve valproik asit gibi kkneobiyotikler. Organik asit, ara metabolizma1’de 100’den fazla reaksiyonda substrat olarak kullanılmasını sağlamak için CoAile enzimatik olarak bir tiyoester bağlantısı oluşturur. CoA tiyoesterler de allosterik düzenleyiciler ve transkripsiyonel aktivatörler vardır. Şimdi takdir2 hücresel toplam CoA kaynağı düzenlenir3,4; böylece, CoA kullanılabilirliği sınırlayıcı olabilir, ve CoA eksiklikleri felaket olabilir, CoA biyosentezi etkileyen kalıtsal genetik bozukluklar tarafından örneklenen5. Pantotenat kinazi CoA biyosentezinin ilk adımını katalizler (Şekil 1) ve Pantotenat Kiaz İlişkili Nörodejenerasyon, PKAN denilen, PANK2 genmutasyonları neden 6 . COA synthase, COASYN geni tarafından kodlanmış, CoA biyosentezinde son iki adımı katalizler(Şekil 1) ve COASY Protein İlişkili Nörodejenerasyon, CoPAN olarak adlandırılan, COASYN genmutasyonuna neden olur7. Hem PKAN hem de CoPAN beyinde demir birikimi ve CoA eksiklikleri ile ilişkili kalıtsal nörodejeneratif hastalıklardır.
Total CoA hücresel düzeyleri dokular arasında değişir8 ve toplam CoA fizyolojik, patolojik ve farmakolojik durumların çeşitli altında artırabilir veya azalabilir. Karaciğer CoA açlık durumuna beslenen yakıt geçiş sırasında artar9, ve karaciğer CoA düzeyleri leptin eksikliği obez farelera anormal derecedeyüksek10. Karaciğer CoA kronik etanol alımına yanıt olarak azalır11. Pank2 nakavt fare modelinde Beyin CoA düzeyleri perinatal dönemde depresif, ancak daha sonra yetişkin aşamasında beyin CoA içeriği vahşi tip düzeyleri eşdeğerdir, geliştirme sırasında adaptif CoA yanıtı gösteren12. Transgenez veya gen iletim yöntemleri ile doku CoA içeriğinin manipülasyonu metabolik ve sinirsel fonksiyonları etkiler13,14,15. PKAN veya CoPAN için potansiyel tedavilerin preklinik gelişimi etkinlik göstergesi olarak hücre veya doku CoA ölçümleri içerir16,17,18,19,20 . Tüm bu durumların ve bunların metabolik veya fonksiyonel sonuçlarının değerlendirilmesi, toplam CoA’nın ölçümü için nicel bir yöntem gerektirir.
Biyolojik numunelerde CoA’nın ölçülmesi için doğru ve güvenilir bir tahlil birçok laboratuvarda teknik bir sorundur. Doğal CoA tiyoesterlerinin analogları enzimleri kullanan CoA esteri çalışmalarında mekanistik problar olarak yaygın olarak kullanılmış olsa da, ne yazık ki, bozulmamış hücrelerde CoA veya CoA tiyoesterlerini değerlendirmek veya ölçmek için kullanılabilir problar bulunmamaktadır21. CoA dönüşüm, serbest sulfhydryl ile (-SH) moiety, bir CoA tiyoester (veya tersi) farklı bir ortama transfer sırasında hücre veya hayvan dokularında hızlı ve hücre lisis sırasında. Hücrelerdeki çok sayıda ayl-CoA sentezi ve acyl-CoA tiyostazları CoA havuzundaki dönüşümlere aracılık eder ve substratlar biyolojik numunelerde kimyasal veya fiziksel olarak söndürülene kadar aktif kalırlar. Anlamına gelir. Acil-transferazlar ile CoA’dan karnitin’e kadar olan asil gruplarının off-loading’i, CoA/CoA tiyoester dağılımını değiştirebilecek reaksiyonlar ağı içinde bir örnektir. Radyoaktif izleyiciler hücrelerde CoA sentezoranlarını ölçmek için kullanılabilir. Biyolojik numunelerde CoA ve CoA türevlerinin ölçülmesi için kullanılan mevcut yöntemler22 gözden geçirilmiştir ve birleştirilmiş enzimatik spektrofotometrik tahliller, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi tabanlı prosedürleri içermektedir. Ancak, bu yöntemler genellikle belirli CoA moleküler türler üzerinde duruldu ve toplam CoA havuzu varyasyon için kör. Birleştirilmiş enzimatik tahliller genellikle düşük algılama hassasiyetleri nedeniyle daha büyük miktarlarda giriş malzemesi gerektirir ve doğrusallık sınırlı bir aralığına sahiptir.
Laboratuvarımız kültürlü hücrelerde ve hayvan dokularında toplam CoA’nın sayısallaştırılması için güvenilir bir prosedür geliştirmiştir. Strateji, coa türlerinin tüm spektrumu korumak ve analiz etmek için çaba sarf etmek yerine, numune hazırlama sırasında sadece serbest CoA verim için tüm CoA tiyoesterlerin hidroliziçerir. Prosedür, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) sonrasında numune hazırlama, CoA türevileştirme, saflaştırma ve tanımlama için bireysel olarak yayınlanan yöntemlerin bir derlemesidir ve türemiş CoA’nın absorbasyon veya floresan algılama23,24,25. Bu prosedür kullanılarak elde edilen CoA tayini, CoA regülasyonu ve CoA eksikliklerinin tedavisi için terapötik bir yaklaşım geliştirilmesini anlamamızı sağlamıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bir emicilik veya floresan çıkış dedektörü ile bir HPLC’ye sahip birçok laboratuvarda erişilebilen çok çeşitli doğrusal algılama ile hücre ve hayvan dokularında toplam CoA’nın ölçülmesi için güvenilir, adım adım bir prosedür gösteriyoruz. Alternatif olarak, kütle spektrometresi CoA ve CoA tiyoesterlerinin değerlendirilmesinde yaygın bir tekniktir, ancak enstrümantasyon maliyeti ve metodoloji ve verilerin yorumlanması için gerekli özel bilgi nedeniyle yaygın olarak mevcut değildir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar CoA Therapeutics, Inc, BridgeBio LLC, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe GM34496 ve Amerikan Lübnan Suriye Associated Charities bir yan kuruluşu tarafından sağlanan sponsorlu araştırma için finansman kabul.
Materials
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
References
- Abiko, Y., Greenburg, D. M. . Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
- Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
- Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
- Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
- Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
- Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
- Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
- Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
- Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
- Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
- Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
- Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
- Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
- Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
- Di Meo, I., et al. Acetyl-4′-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
- Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
- Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
- Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
- Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
- Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
- Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
- Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) – Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
- Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
- Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
- Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
- Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).
