Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

La coenzima A (CoA) es un cofactor esencial en todos los organismos vivos y se sintetiza a partir del ácido pantoténico, también llamado pantotenato (la sal de ácido pantoténico) o vitamina B5. El CoA es el principal portador intracelular de ácidos orgánicos, incluyendo ácidos de cadena corta como acetato y succinato, ácidos de cadena ramificada como propionato y metilmalnato, ácidos grasos de cadena larga como palmitato y oleato, ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos poliinsaturados, y xenobióticos como el ácido valproico. El ácido orgánico forma un enlace tioésico enzimáticamente con CoA para permitir su uso como sustrato en más de 100 reacciones en el metabolismo intermediario¹. Los tióreros de CoA también son reguladores alostéricos y activadores transcripcionales. Ahora se aprecia² que el suministro de CoA total celular está regulado^3,4; por lo tanto, la disponibilidad de CoA puede ser limitante, y que las deficiencias de CoA pueden ser catastróficas, como lo ejemplifican los trastornos genéticos hereditarios que afectan la biosíntesis de CoA⁵. La pantotenato quinasa cataliza el primer paso de la biosíntesis de CoA (Figura 1) y la Neurodegeneración Asociada a Pantotenato Kinasa, llamada PKAN, es causada por mutaciones en el gen PANK2 ⁶. La coA sintasa, codificada por el gen COASYN, cataliza los dos últimos pasos de la biosíntesis de CoA (Figura 1) y la Neurodegeneración Asociada a Proteína COASY, llamada CoPAN, es causada por una mutación en el gen COASYN ^7. Tanto PKAN como CoPAN son enfermedades neurodegenerativas hereditarias asociadas con la acumulación de hierro en el cerebro y las deficiencias de CoA subyacentes a las patologías de la enfermedad.

Los niveles celulares de CoA total varían entre los tejidos⁸ y el CoA total puede aumentar o disminuir bajo una variedad de estados fisiológicos, patológicos y farmacológicos. El coA hepático aumenta durante el cambio de combustible de la alimentada al estado de ayuno⁹, y los niveles de CoA hepático son anormalmente altos en ratones obesos con deficiencia de leptina¹⁰. El coA hepático disminuye en respuesta a la ingestión crónica de etanol¹¹. Los niveles de CoA cerebral en el modelo de ratón Nocaut Pank2 están deprimidos durante el período perinatal, pero más tarde en la etapa adulta el contenido de CoA del cerebro es equivalente a los niveles de tipo salvaje, lo que indica una respuesta de CoA adaptable durante el desarrollo^12. La manipulación del contenido de coA tisular por transgénesis o métodos de administración de genes afecta a las funciones metabólicas y neuronales^13,14,15. El desarrollo preclínico de posibles terapias para PKAN o CoPAN incluye mediciones de CoA celular o tisular como indicadores de eficacia^{16,17,18,19,20} . La evaluación de todas estas condiciones y sus consecuencias metabólicas o funcionales requiere un método cuantitativo para la medición del CoA total.

Un ensayo preciso y fiable para medir el CoA en muestras biológicas es un desafío técnico en muchos laboratorios. Desafortunadamente, no hay sondas disponibles para evaluar o cuantificar tioesters de CoA o CoA en células intactas, aunque los análogos de los tioesters coA naturales se han utilizado ampliamente como sondas mecanicistas en estudios de éster CoA utilizando enzimas^21. La conversión de CoA, con una mitad libre de sulfhidilo (-SH), a un tioester de CoA (o viceversa) es rápida en las células o tejidos animales durante la transferencia a un ambiente diferente y durante la lisis celular. Numerosas acomodatinosas y tilatirasas ayl-CoA en células median las interconversiones dentro de la piscina de CoA, y enzimas adicionales que utilizan tióreros de CoA como sustratos permanecen activos en muestras biológicas hasta que son apagones por sustanciaquímica o física Significa. La descarga de grupos de acil de CoA a carnitina por acil-transferasas es un ejemplo dentro de la red de reacciones que pueden alterar la distribución del tioester CoA/CoA. Los trazadores radiactivos se pueden utilizar para medir las tasas de síntesis de CoA en las células. Los métodos actuales para medir los derivados de CoA y CoA en muestras biológicas se han revisado²² e incluyen ensayos espectrofotométricos enzimáticos acoplados, cromatografía líquida de alta presión y procedimientos basados en espectrometría de masas. Sin embargo, estos métodos a menudo se centran en especies moleculares de CoA particulares y son ciegos a la variación de la piscina total de CoA. Los ensayos enzimáticos acoplados generalmente requieren mayores cantidades de material de entrada debido a las sensibilidades de detección bajas y tienen un rango limitado de linealidad.

Nuestro laboratorio ha desarrollado un procedimiento fiable para la cuantificación del CoA total en células cultivadas y tejidos animales. La estrategia incluye hidrólisis de todos los tioesters de CoA para producir sólo CoA libre durante la preparación de la muestra, en lugar de hacer esfuerzos para mantener y analizar todo el espectro de especies de CoA. El procedimiento es una compilación de métodos individuales publicados para la preparación de muestras, derivación de CoA, purificación e identificación después de cromatografía líquida de alta presión (HPLC), y cuantificación del CoA derivatizado por absorbancia o detección de fluorescencia^23,24,25. Las determinaciones de CoA obtenidas mediante este procedimiento han permitido nuestra comprensión de la regulación del CdA y el desarrollo de un enfoque terapéutico para el tratamiento de las deficiencias de CoA.