Количественная оценка коэнзима А в клетках и тканях

Коэнзим А (CoA) является незаменимым кофактором во всех живых организмах и синтезируется из пантотеновой кислоты, также называемой пантотенатом (соль пантотеновой кислоты) или витамина В5. КоА является основным внутриклеточным носителем органических кислот, включая короткоцепочечные кислоты, такие как ацетат и суччатый, ветвяные кислоты, такие как пропионат и метилмалонат, длинноцепочечные жирные кислоты, такие как пальмитат и олеат, очень длинноцепочечные жирные кислоты, такие как полиненасыщенные жирные кислоты и ксенобиотики, такие как вальпроевая кислота. Органическая кислота образует тиоэстер связи ферментативно с КоАп, чтобы его использование в качестве субстрата в более чем 100 реакций в промежуточных^{метаболизм1}. CoA thioesters также аллостерические регуляторы и транскрипционные активаторы. В настоящее время^{оценили 2,} что сотовый общий объем поставок КоАП регулируется^3,4; таким образом, доступность КоАп может быть ограничена, и что недостатки КоАП могут быть катастрофическими, о чем служат наследственные генетические расстройства, которые влияют на биосинтез CoA^5. Пантотенат киназы катализирует первый шаг в биосинтезе CoA (Рисунок 1) и Pantothenate Киназы Ассоциированные нейродегенерации, называется PKAN, вызвано мутациями в гене PANK2 ⁶. CoA synthase, кодируется геном COASYN, катализирует последние два шага в биосинтезе CoA(Рисунок 1)и COASY Protein-Associated Neurodegeneration, называемой CoPAN, вызвана мутацией в гене COASYN ⁷. Оба PKAN и CoPAN являются наследственные нейродегенеративные заболевания, связанные с накоплением железа в головном мозге и Недостатки КоАП недостаточно патологии болезни.

Клеточные уровни общего КоА варьируются между тканями⁸ и общего КоА может увеличиваться или уменьшаться при различных физиологических, патологических и фармакологических состояний. Печень Коа увеличивается во время переключения топлива из корма в постное состояние⁹, и печени CoA уровни аномально высока в лептин-дефицитных тучных мышей¹⁰. Печень КоА уменьшается в ответ на хроническое проглатывание этанола¹¹. Мозг CoA уровни в модели Pank2 нокаут мыши депрессии в течение перинатального периода, но позже на взрослой стадии мозга содержание мозга CoA эквивалентно диким типа уровней, что свидетельствует о адаптивной реакции КоАп во время развития¹². Манипуляция содержанием коэнзии с помощью трансгенеза или методов доставки генов влияет на метаболические и нервные функции^13,14,15. Доклиническое развитие потенциальных методов лечения PKAN или CoPAN включает измерения КоАп клеток или тканей в качестве показателей эффективности^{16,17,18,19,20} . Оценка всех этих состояний и их метаболических или функциональных последствий требует количественного метода измерения общего КоАп.

Точный, надежный анализ для измерения КоАп в биологических образцах является технической проблемой во многих лабораториях. К сожалению, Есть нет зондов, доступных для оценки или количественно CoA или CoA thioesters в нетронутых клеток, хотя аналоги природных CoA тиесты были широко использованы в качестве механистических зондов в исследованиях CoA эфира с использованием ферментов²¹. Преобразование КоАп, с помощью свободного сульфидрила (-SH) муэти, в коап thioester (или наоборот) является быстрым в клетках или тканях животных во время передачи в другую среду и во время лизиса клеток. Многочисленные синтезаторы acyl-CoA и ацил-КоА тиостасесы в клетках посредничают интерконверсии в пуле КоАП, а также дополнительные ферменты, которые используют коап тиестеры в качестве субстратов, остаются активными в биологических образцах до утопленного химическими или физическими Означает. Разгрузка ацил-групп от КоАп до карнитина ацил-трансферазами является одним из примеров в рамках сети реакций, которые могут изменить распределение тиоэстера CoA/CoA. Радиоактивные трассы могут быть использованы для измерения темпов синтеза КоАП в клетках. Текущие методы измерения производных КоАп и КоА в биологических образцах были рассмотрены²² и включают в себя соединенные энзиматические спектромеметрические анализы, жидкой хроматографии высокого давления и процедуры, основанные на масс-спектрометрии. Тем не менее, эти методы часто сосредоточены на конкретных молекулярных видов КоАП и слепы к изменению общего пула КоАП. Соединенные ферментативные анализы обычно требуют большего количества входного материала из-за низкой чувствительности обнаружения и имеют ограниченный диапазон линейности.

Наша лаборатория разработала надежную процедуру количественной оценки общего объема КоАП в культивированных клетках и тканях животных. Стратегия включает в себя гидролиз всех КоАП тиоэстеров, чтобы дать только бесплатно CoA во время подготовки образцов, а не прилагать усилия для поддержания и анализа всего спектра видов КоАП. Процедура представляет собой компиляцию отдельных опубликованных методов подготовки образцов, деиватации КоА, очистки и идентификации после жидкой хроматографии высокого давления (HPLC), а также количественной оценки производного КоА путем абсорбции или флуоресценция^23,24,25. Определения КоАП, полученные с помощью этой процедуры, позволили нам понять регулирование КоАП и разработку терапевтического подхода к лечению недостатков КоАП.