Quantifizierung von Coenzym A in Zellen und Geweben

Coenzym A (CoA) ist ein wesentlicher Cofaktor in allen lebenden Organismen und wird aus Pantothensäure, auch Pantothenat (das Salz der Pantothensäure) oder Vitamin B5 genannt, synthetisiert. CoA ist der wichtigste intrazelluläre Träger organischer Säuren, einschließlich kurzkettiger Säuren wie Acetat und Succinat, verzweigtkettige Säuren wie Propionat und Methylmalonat, langkettige Fettsäuren wie Palmitat und Oleat, sehr langkettige Fettsäuren wie mehrfach ungesättigten Fettsäuren und Xenobiotika wie Valproinsäure. Die organische Säure bildet eine Thioester-Verbindung enzymatisch mit CoA, um ihre Verwendung als Substrat bei über 100 Reaktionen im Zwischenstoffwechsel zu ermöglichen¹. CoA-Thioester sind auch allosterische Regulatoren und Transkriptionsaktivatoren. Es wird nun^{geschätzt 2,} dass die zelluläre Gesamt-CoA-Versorgung reguliert ist^3,4; Daher kann die CoA-Verfügbarkeit begrenzt sein, und dass CoA-Mängel katastrophal sein können, wie vererbte genetische Störungen zeigen, die sich auf die CoA-Biosynthese^{auswirken 5}. Pantothenatkinase katalysiert den ersten Schritt in der CoA-Biosynthese (Abbildung 1) und Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, genannt PKAN, wird durch Mutationen im PANK2-Gen ⁶verursacht. CoA-Synthase, kodiert durch das COASYN-Gen, katalysiert die letzten beiden Schritte in der CoA-Biosynthese (Abbildung 1) und COASY Protein-Associated Neurodegeneration, genannt CoPAN, wird durch eine Mutation im COASYN-Gen ^{verursacht 7}. Sowohl PKAN als auch CoPAN sind vererbte neurodegenerative Erkrankungen, die mit der Eisenakkumulation im Gehirn verbunden sind, und CoA-Mangel unterbewertet die Krankheitspathologien.

Die Zellulären Konzentrationen der gesamten CoA variieren zwischen^{Geweben 8} und Gesamt-CoA kann unter einer Vielzahl von physiologischen, pathologischen und pharmakologischen Zuständen erhöhen oder abnehmen. Leber CoA erhöht während kraftstoffumstellung von der Fütterung in den gefasteten Zustand⁹, und Leber CoA-Spiegel sind ungewöhnlich hoch bei Leptin-mangelhafte fettleibige Mäuse¹⁰. Leber CoA nimmt als Reaktion auf chronische Ethanol-Aufnahme¹¹ab. Gehirn CoA-Spiegel im Pank2 Knockout-Maus-Modell sind während der perinatalen Periode depressiv, aber später im Erwachsenenstadium Gehirn CoA-Gehalt ist gleich wilde-Typ-Ebenen, was auf eine adaptive CoA-Antwort während der Entwicklung¹². Die Manipulation des CoA-Gehalts des Gewebes durch Transgenese oder Genabgabemethoden wirkt sich auf metabolische und neuronale Funktionen^{aus 13,14,15}. Die präklinische Entwicklung potenzieller Therapien für PKAN oder CoPAN umfasst Zell- oder Gewebe-CoA-Messungen als Indikatoren für die Wirksamkeit^{16,17,18,19,20} . Die Bewertung all dieser Bedingungen und ihrer metabolischen oder funktionellen Folgen erfordert eine quantitative Methode zur Messung der gesamten CoA.

Ein genauer, zuverlässiger Test zur Messung von CoA in biologischen Proben ist in vielen Labors eine technische Herausforderung. Leider gibt es keine Sonden zur Bewertung oder Quantifizierung von CoA- oder CoA-Thioestern in intakten Zellen, obwohl Analoga natürlicher CoA-Thioester weit verbreitet als mechanistische Sonden in Studien mit CoA-Ester unter Verwendung von Enzymen²¹verwendet wurden. Die Umwandlung von CoA, mit einem freien Sulfhydryl (-SH) Moiety, zu einem CoA-Thioester (oder umgekehrt) ist schnell in Zellen oder tierischen Geweben während der Übertragung in eine andere Umgebung und während der Zelllyse. Zahlreiche Acyl-CoA-Synthetasen und Acyl-CoA-Thioesterasen in Zellen vermitteln die Interkonversionen innerhalb des CoA-Pools, und zusätzliche Enzyme, die CoA-Thioester als Substrate nutzen, bleiben in biologischen Proben aktiv, bis sie durch chemische oder physikalische mittel. Die Auslagerung von Acylgruppen von CoA zu Carnitin durch Acyltransferasen ist ein Beispiel innerhalb des Netzwerks von Reaktionen, die die CoA/CoA-Thioester-Verteilung verändern können. Radioaktive Tracer können verwendet werden, um die CoA-Syntheseraten in Zellen zu messen. Die aktuellen Methoden zur Messung von CoA- und CoA-Derivaten in biologischen Proben wurden²² überprüft und umfassen gekoppelte enzymatische spektrophotometrische Assays, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und massenspektrometriebasierte Verfahren. Diese Methoden konzentrieren sich jedoch häufig auf bestimmte CoA-Molekulararten und sind blind für Variationen des gesamten CoA-Pools. Die gekoppelten enzymatischen Assays erfordern aufgrund geringer Detektionsempfindlichkeiten in der Regel größere Mengen an Eingangsmaterial und weisen einen begrenzten Linearitätsbereich auf.

Unser Labor hat ein zuverlässiges Verfahren zur Quantifizierung des gesamten CoA in kultivierten Zellen und tierischen Geweben entwickelt. Die Strategie umfasst die Hydrolyse aller CoA-Thioester, um während der Probenvorbereitung nur freies CoA zu liefern, anstatt sich um die Erhaltung und Analyse des gesamten Spektrums der CoA-Arten zu bemühen. Das Verfahren ist eine Zusammenstellung einzelner veröffentlichter Methoden zur Probenvorbereitung, CoA-Ableitung, Reinigung und Identifizierung nach Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Quantifizierung des derivatisierten CoA durch Absorption oder Fluoreszenzdetektion^23,24,25. Die mit diesem Verfahren gewonnenen CoA-Bestimmungen haben unser Verständnis der CoA-Regulierung und die Entwicklung eines therapeutischen Ansatzes zur Behandlung von CoA-Mängeln ermöglicht.