Kesinlikle Anaerobik/Anoksik Koşullarda Mikroorganizmaların Yetiştirilmesi için Orta Hazırlık
Summary
Zorunlu anaerobik organizmalar oksijene maruz kaldıktan sonra büyüyemedikleri için anaerobik kültür tekniklerinin kullanımı vazgeçilmezdir. Burada, medya hazırlığından gaz ve uçucu yağ asidi nicelleştirmesine kadar bir biyogaz bitkisinden elde edilen karışık bir kültürü yetiştirmek için basit ve etkili bir yöntem gösteriyoruz.
Abstract
Aerobik organizmaların aksine, kesinlikle anaerobik mikroorganizmalar oksijen yokluğu ve büyüme başlatmak için genellikle düşük bir redoks potansiyeli gerektirir. Oksijen havada her yerde olduğu için, ekimin tüm adımları sırasında O2-serbest koşulları istinat zor ama anaerobik kültüriçin bir ön koşuldur. Burada sunulan protokol, basit ve ucuz bir yöntem le biyogaz bitkisinden elde edilen anaerobik karma kültürün başarılı bir şekilde yetiştirilmesinin olduğunu göstermektedir. Tüm anoksik kültür sürecinin kesin bir açıklaması medya hazırlama, yetiştirme şişelerinin doldurulması, redoks indikatörü ile takviyesi ve düşük redoks potansiyeli sağlamak için ajanlar azaltılması yanı sıra tutmak için headspace alışverişi de dahil olmak üzere verilir oksijensiz medya. Ayrıca, aseptik aşılama gaz sıkı serum şişeleri ayrıntılı bir bakış (steril şırınga ve iğneler kullanılarak) ve uygun kuluçka koşulları sağlanır. Bu protokol, gaz kromatografisi (GC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak gaz bileşimi ve uçucu yağ asidi konsantrasyonları ile ilgili sonraki analizler için gaz ve sıvı numune alma ile ilgili ideal gaz yasası göz önünde bulundurularak biyogaz ve metan veriminin hesaplanması.
Introduction
Dünya üzerinde önemli konsantrasyonlarda moleküler oksijen atmosfer ile doğrudan temas eden alanlarda veya oksijenli fototrofların varlığında mevcuttur. Oksijenin olmadığı ortamlara anaerobik denir. Ancak, enerji dönüşüm hala iki farklı metabolik süreçler, fermantasyon ve anaerobik solunum1ile anaerobik koşullar altında mümkündür.
Aerobik solunum geçiren organizmalar terminal elektron kabul edici olarak oksijen kullanırken, anaerobik solunum nitrat veya sülfat2 gibi alternatif elektron kabul ediciler gerektirir. “Elektron kulesi” olarak adlandırılan, redoks çiftleri en negatif olanlar üstte (elektron donörleri) ve en altta pozitif redoks potansiyeline sahip en güçlü oksidasyon ajanları (elektron alıcıları) ile redoks potansiyellerine göre düzenlenirler. Donörler ve kabul edenler arasındaki elektron transferi sözde solunum zinciri üzerinden enerji tasarrufu yol açar ve elektronlar elektron kabul edenler tarafından yakalanabilir – resimde kalmak için – kulenin farklı katlarında. Bu nedenle, elektronların elektron kulesinden düşmesi ne kadar yüksekse, ilgili reaksiyon la o kadar fazla enerji korunabilir. Bu nedenle, solunum da anaerobik habitatlarda mümkündür, örneğin, NO3dahil redoks çiftleri ile–/NO2–, fumarik asit / süksinik asit, SO32-/H2S, S°/H2S, Mn(IV)/Mn(II ), Fe(III)/Fe(II)2,3. İlk olarak, elde edilen enerji membran potansiyeli olarak korunur, daha sonra membranbağlı ATP-sintalseler tarafından adenozin-trifosfat (ATP) sentezi için elektron taşıma fosforilasyon tarafından kullanılır. Aerobik solunum aksine, anaerobik solunum tarafından korunabilir enerji miktarı önemli ölçüde azaltılabilir; ancak, en anaerobik solunum enerji çıkışı hala fermantasyon ile karşılaştırıldığında daha yüksektir, oksijen ve diğer terminal elektron alıcılar 2 eksik habitatlarda bir anaerobik enerji koruma yolu.
Fermantasyon sırasında, enerji açısından zengin, organik substratlar genellikle genel sürecin adını tanımlayan çeşitli fermantasyon ürünleri, örneğin, alkollü fermantasyon bozulur. Solunum süreçlerinin aksine, fermantasyon sırasında ATP üretimi, enerji açısından zengin fosforlu substrat 2’den adenozin-di-fosfata (ADP) aktarılan substrat düzeyinde fosforilasyon ile sınırlıdır. Fermantasyon mikroorganizmaları, substrat dökümünde anahtar oyuncular oldukları için organik maddenin anaerobik bozulmasında merkezi bir rol oynarlar. Birincil fermantasyon ürünleri, organik asitler gibi, alkoller, CO2, ve H2, daha sonra asetik asit üretmek için ikincil fermantasyon mikroorganizmalar tarafından kullanılabilir, CO2, ve H2. Fermantasyon ürünleri için örnekler laktik asit, çeşitli uçucu yağ asitleri (formik, asetik-, propiyonik-, bütirik-, valeric asit), n-butanol, 2,3-butandiol, aseton ve etanol içerir.
Mikroorganizmaların kesinlikle anaerobik koşullarda yetiştirilmesi, aerobik organizmaların yetiştirilmesine kıyasla tamamen farklı yöntem ve ekipmanlar gerektirir. Oksijene dayanıklı organizmalar genellikle agar yemekleri, sözde yüzey kültürleri üzerinde yetiştirilen iken, bu – birkaç istisna dışında – neredeyse kesinlikle anaerobik mikroorganizmalar için mümkündür. Bu nedenle, kesinlikle anaerobik mikroorganizmaların zenginleştirme kültürleri esas olarak bir oksijen-free headspace atmosfer4sağlamak gaz geçirmez septa ile mühürlü kültür kapları uygulayarak sıvı ortamda kurulmuştur 4,6, 7 .
Mevcut protokol tanımı, anaerobik biyogaz bitkisinden elde edilen karışık popülasyondaki hedef mikroorganizmalar için uygun yetiştirme yöntemleri sağlayacaktır. Saf kültürlerin izole edilmesi ve yetiştirilmesi daha da zor ama bu çalışmanın bir parçası değildir.
Burada, proteinaceous substratların anaerobik sindirim sırasında fenil asitoluşumu ile ilgili bir çalışmaya dayalı bir anaerobik mikrobiyal topluluk yetiştirmek için prosedür göstermek8. Mikrobiyal topluluk anaerobik sindirimin dört evresinden üyelerden oluşuyordu: hidroliz, asidozez, asetongenez ve metanogenez. Bir mineral tuz orta karbon kaynağı ile takviye, redoks-indikatör, vitamin ve iz element çözeltisi ve azaltıcı ajan uygulandı9. Ortam ilgili proteinaceous fenil asit öncüsü substratlarıiledeğiştirilmiştir 8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Anaerobik mikroorganizmaların kültüre atılmasında en önemli ve kritik adım, yetiştirme ortamlarında ve şişelerin kafa boşluğunda oksijensiz koşullar sağlamaktır. Resazurin gibi bir gösterge dolaylı olarak şişelerin doğru anaerobik dolgu kontrol etmek için kullanılabilir. Resazurin ucuz olduğu gibi yaygın olarak kullanılan redoks boya, toksik olmayan, ve zaten düşük dozlarda ve kısa kuluçka süreleri etkili 12. Ne zaman medya dahil, mavi renkli resazurin ilk nötr pH değerlerinde pembe resorufin için geri dönüşü olmayan bir azaltma adımı uğrar. Bu ilk reaksiyon ortam 13ısıtıldığında oluşabilir. Daha sonra, resorufin renksiz dihidroresorufin bir geri dönüşümlü ikincil reaksiyon azalır (Şekil 7)12. Resorufin/dihidroresorufin redoks sistemi, standart oksidasyon azaltma potansiyeline göre tamamen renksiz hale gelir ve yaklaşık Eh = -110 mV ve -51 mV 13redoks potansiyelinin üzerinde pembeye döner.
Redoks potansiyelini daha da azaltmak için, örneğin, -200 mV 14’ten daha azihtiyaç duyduğu bilinen metanojenik mikroorganizmaların büyümesini kolaylaştırmak için, bir Na2S çözeltisi eklenebilir. Alternatif olarak, sistein-HCl, sodyum-tiyoglikolat veya sodyum dithionite yaygın olarak kullanılır. Ancak, hangi azaltma aracısının kullanılması uygundur ilgili deneysel kuruluma bağlıdır ve özel dikkat gerektirebilir. Örneğin, sodyum tiyogliserin sıcaklık aktivasyonu (örneğin, otoklavlama) gerekir.
Bakteri ve Arkelerin çeşitli cinslerinden oluşan dengeli bir mikrobiyal konsorsiyum ve verimli bir şekilde çalışan anaerobik bozulma kaskad, gaz yoluyla kültür şişelerinde kafa boşluğu gaz bileşimi belirlenerek daha da değerlendirilebilir. Kromatografi. Farklı öncüllerden elde edilen fenil asitler gibi bileşikleri işlerken, kafa boşluğunun değerlendirilmesi metanogenez sürecini kontrol etmenin hızlı bir yoludur8. Kuluçka döneminin sonunda kontrollerde yaklaşık %50-60’lık bir headspace CH4 konsantrasyonu, uygulanan besinlerin başarılı bir şekilde kullanılmasını ve böylece anaerobik koşullarda organik maddelerin mineralizasyonunu gösterir. Sindirim işlemi sırasında teorik metan üretimi ve beklenen metan konsantrasyonları substrat temel analizi sonra Buswell-Boyle denklemine göre ex ante belirlenebilir veya içeriğini tahmin ederek substratkarbonhidratlar, proteinler ve yağlar. VDI 4630 15’egöre karbonhidratlar 750 L kg-1 VSS (%50 CH4 ve %50 CO2),proteinlerden 800 L kg-1 VSS’ye (%72 CH4 ve %28 CO2)teorik biyogaz üretimine ve 1.390 L kg’a kadar yağ üretimine yol açabilir -1.02.20 VSS (%60 CH4 ve %40 CO2).
Ayrıca VA’ların ve fenil asitlerin oluşumu ve sonraki bozulmaları izlendi. Bozulma süreci, farklı zaman noktalarında VFA konsantrasyonları (örn. asetat, propiyonat) analiz edilerek değerlendirilebilir. Asetat ve/veya propiyonat gibi kısa zincirli yağ asitlerinin birikmesi, metanojenik topluluk bileşimindeki bozukluklara ve genel bir reaktör aşırı yüküne işaret edebilir. Ancak, iyi dengelenmiş mikrobiyal bozulma kaskad bile çok yüksek VFA ve asetat konsantrasyonları ile başa çıkabilir9. Ayrıca, asetat / propiyonat oranı daha genel reaktör durumu hakkında bilgi sağlayabilir16. Ancak, önerilen deneysel hipotezlere göre seçilmesi gereken proses izleme için uygun birçok parametre vardır. Bu örnekte hedef değişkenler fenil asit konsantrasyonları idi (Şekil 6).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Avusturya Bilim Fonu (FWF) tarafından finanse edilmiştir: proje numaraları P 29360 ve P 29143. Yayın Publikationsfonds der Universität Innsbruck tarafından desteklendi. EIG’yi büyük ölçüde kabul ediyoruz.
Materials
| culture flasks (120 mL, N20) | Ochs, Germany | 102046 | |
| buty rubber septa (N20) | Ochs, Germany | 102049 | |
| aluminium caps (N20) | Ochs, Germany | 102050 | |
| N2 gas | Messer, Austria | purity 5.0 | |
| syringes + cannulae | various | ||
| crimper | Ochs, Germany | 102051 | |
| de-crimper | Ochs, Germany | 102052 | |
| GC2010 | Shimadzu | ||
| Shin-carbon GC column | Restek | chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2 | |
| HPLC Prominence | Shimadzu | ||
| Fast Fruit HPLC Column | Phenomenex | chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc. |
References
- Wiebe, W. J., Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G., et al. Anaerobic Respiration and Fermentation. The Ecology of a Salt Marsh. , 137-159 (1981).
- Kim, B. H., Gadd, G. M., Kim, B. H., Gadd, G. M. Anaerobic fermentation. Bacterial physiology and metabolism. , 252-297 (2008).
- Stolz, J. F., Oremland, R. S. Bacterial respiration of arsenic and selenium). FEMS Microbiology Reviews. 23 (5), 615-627 (1999).
- Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic Methanogenesis and Autotrophic Growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
- Mutschlechner, M., Praeg, N., Illmer, P. The ecological importance of grazing to methane fluxes and engaged microbial communities in alpine forest soils. FEMS Microbiology Ecology. , (2018).
- Prem, E. M., Reitschuler, C., Illmer, P. Livestock grazing on alpine soils causes changes in abiotic and biotic soil properties and thus in abundance and activity of microorganisms engaged in the methane cycle. European Journal of Soil Biology. 62, 22-29 (2014).
- Praeg, N., Wagner, A. O., Illmer, P. Effects of fertilisation, temperature and water content on microbial properties and methane production and methane oxidation in subalpine soils. European Journal of Soil Biology. 65, 96-106 (2014).
- Wagner, A. O., Prem, E. M., Markt, R., Kaufmann, R., Illmer, P. Formation of phenylacetic acid and phenylpropionic acid under different overload conditions during mesophilic and thermophilic anaerobic digestion. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 359 (2019).
- Lins, P., Malin, C., Wagner, A. O., Illmer, P. Reduction of accumulated volatile fatty acids by an acetate-degrading enrichment culture. FEMS Microbiology Ecology. 71 (3), 469-478 (2010).
- Wagner, A. O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. Effects of different nitrogen sources on the biogas production – a lab-scale investigation. Microbiological research. 167 (10), 630-636 (2012).
- Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
- Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds. Biomaterials. 129, 163-175 (2017).
- Costilow, R. N., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., et al. Physicochemical Factors in Growth. Methods for General and Molecular Microbiology. , 309-329 (2007).
- Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review. European Journal of Soil Biology. 37 (1), 25-50 (2001).
- . Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material. VDI Richtlinien. , (2006).
- Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
