Preparación media para el cultivo de microorganismos bajo condiciones estrictamente anaeróbicas/anóxicos
Summary
Como los organismos anaeróbicos obligatorios son incapaces de crecer al exponerse al oxígeno, el uso de técnicas de cultivo anaeróbico es indispensable. Aquí, demostramos un método simple y eficaz para cultivar un cultivo mixto derivado de una planta de biogás desde la preparación de medios hasta la cuantificación de gases y ácidos grasos volátiles.
Abstract
A diferencia de los organismos aeróbicos, los microorganismos estrictamente anaeróbicos requieren la ausencia de oxígeno y, por lo general, un bajo potencial de redox para iniciar el crecimiento. Como el oxígeno es omnipresente en el aire, conservar las condiciones libres de O2durante todos los pasos del cultivo es un reto, pero un requisito previo para el cultivo anaeróbico. El protocolo presentado aquí demuestra el cultivo exitoso de un cultivo mixto anaeróbico derivado de una planta de biogás utilizando un método simple y barato. Se da una descripción precisa de todo el proceso de cultivo anóxico, incluida la preparación de los medios de cultivo, el llenado de matraces de cultivo, la suplementación con indicador de redox y los agentes reductores para proporcionar bajos potenciales de redox, así como el intercambio del espacio de la cabeza para mantener libres de oxígeno. Además, se proporciona una descripción detallada de los matraces séricos herméticos de gas (mediante el uso de jeringas y agujas estériles) y condiciones de incubación adecuadas. El presente protocolo se ocupa además del muestreo de gases y líquidos para análisis posteriores relativos a la composición del gas y las concentraciones de ácidos grasos volátiles mediante cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), respectivamente, y la cálculo del biogás y el rendimiento del metano teniendo en cuenta la ley de gas ideal.
Introduction
En la tierra oxígeno molecular en concentraciones notables está disponible en áreas que tienen contacto directo con la atmósfera o en presencia de fototróficos oxigenados. Los entornos en los que el oxígeno está ausente se denominan anaeróbicos. Sin embargo, la conversión de energía todavía es posible en condiciones anaeróbicas a través de dos procesos metabólicos diferentes, fermentación y respiración anaeróbica1.
Mientras que los organismos sometidos a respiración aeróbica están utilizando oxígeno como un aceptador de electrones terminal, la respiración anaeróbica requiere aceptadores de electrones alternativos como nitrato o sulfato2. En la llamada “torre de electrones”, las parejas redox se organizan de acuerdo a su potencial redox, con los más negativos situados en la parte superior (donantes de electrones) y los agentes de oxidación más fuertes con potencial redox positivo en la parte inferior (aceptadores de electrones). La transferencia de electrones entre donantes y aceptadores conduce a la conservación de la energía a través de la llamada cadena respiratoria y los electrones pueden ser capturados por los aceptadores de electrones – para permanecer en la imagen – en diferentes pisos de la torre. Por lo tanto, cuanto mayor sea la caída de electrones a través de la torre de electrones, más energía se puede conservar por la reacción respectiva. Por lo tanto, la respiración también es posible en hábitats anaeróbicos, por ejemplo, con pares de oxox rojo incluyendo NO3–/NO2–, ácido fumarico/ácido succínico, SO32-/ H2S, S /H2S, Mn(IV)/Mn(II ), Fe(III)/Fe(II)2,3. En primer lugar, la energía resultante se conserva como potencial de membrana, que posteriormente es utilizado por la fosforilación de transporte de electrones para la síntesis de adenosina-trifosfato (ATP) por membrana unida ATP-synthasas. A diferencia de la respiración aeróbica, la cantidad de energía que puede ser conservada por la respiración anaeróbica puede reducirse drásticamente; sin embargo, la producción de energía de la mayoría de las respiraciones anaeróbicas es aún mayoren comparación con la fermentación, una ruta de conservación de energía anaeróbica en hábitats que carecen de oxígeno y otros aceptadores de electrones terminales 2.
Durante la fermentación, los sustratos orgánicos ricos en energía se degradan a varios productos de fermentación que a menudo definen el nombre del proceso general, por ejemplo, la fermentación alcohólica. A diferencia de los procesos de respiración, la generación de ATP durante la fermentación se limita a la fosforilación a nivel desustrato durante la cual un grupo de fosfato se transfiere a adenosina-difosfato (ADP) a partir de un sustrato fosforilado rico en energía 2. Los microorganismos fermentadores desempeñan un papel central en la degradación anaeróbica de la materia orgánica, ya que son actores clave en la descomposición del sustrato. Los productos de fermentación primaria, como los ácidos orgánicos, alcoholes, CO2y H2,pueden ser utilizados posteriormente por microorganismos de fermentación secundaria para producir ácido acético, CO2y H2. Ejemplos para los productos de fermentación incluyen ácido láctico, varios ácidos grasos volátiles (formático-, acético-, propionic-, butírico-, ácido valerico), n-butanol, 2,3-butandiol, acetona, y etanol.
El cultivo de microorganismos en condiciones estrictamente anaeróbicas requiere métodos y equipos completamente diferentes en comparación con el cultivo de organismos aeróbicos. Mientras que los organismos tolerantes al oxígeno a menudo se cultivan en platos de agar, los llamados cultivos superficiales, esto es – con algunas excepciones – difícilmente posible para los microorganismos estrictamente anaeróbicos. Por lo tanto, los cultivos de enriquecimiento de microorganismos estrictamente anaeróbicos se establecen principalmente en medios líquidos que aplican recipientes de cultivo sellados con septos herméticos a gas que aseguran una atmósfera de espacio libre de oxígeno4,6, 7.
La descripción actual del protocolo proporcionará métodos de cultivo adecuados para los microorganismos objetivo de una población mixta derivados de una planta de biogás anaeróbico. El aislamiento y el cultivo de las culturas puras es aún más difícil, pero no parte de esta obra.
Aquí, mostramos el procedimiento para el cultivo de una comunidad microbiana anaeróbica basada en unestudio sobre la formación de ácidos fenil durante la digestión anaeróbica de sustratos proteicos 8. La comunidad microbiana estaba formada por miembros de las cuatro fases de la digestión anaeróbica: hidrólisis, acidogénesis, acetogénesis y metanogénesis. Se aplicó un medio de sal mineral complementado con una fuente de carbono, redox-indicador, solución de vitamina y oligoelemento, y agente reductor9. El medio fue modificado con los respectivos sustratos precursores de fenilácido proteico8.
Protocol
Representative Results
Discussion
El paso más importante y crítico en el cultivo de microorganismos anaeróbicos es garantizar condiciones libres de oxígeno en los medios de cultivo y el espacio en la cabeza de los matraces. Un indicador como la resazurina se puede utilizar para comprobar indirectamente el llenado anaeróbico correcto de los matraces. Resazurin es un tinte redox comúnmente utilizado ya que es barato, no tóxico, y ya eficaz en dosis bajas y corta incubación veces 12. Cuando se incorpora a los medios, la resazurina de color azul primero sufre un paso de reducción irreversible a la resorulina, que es de color rosa a valores de pH neutros. Esta primera reacción puede ocurrir cuando los medios se calientan 13. Posteriormente, la resorufina se reduce a dihidrorresorufina incolora en una reacción secundaria reversible (Figura 7)12. El sistema redox de resorufina/dihidroresorufina se vuelve completamente incoloro en un potencial estándar de reducción de la oxidación de aproximadamente Eh -110 mV y se vuelve rosa por encima de un potencial redox de -51 mV 13.
Con el fin de reducir aún más el potencial de los redox, por ejemplo, para facilitar el crecimiento de microorganismos metanogénicos que se sabe que requieren menos de -200 mV14, se puede añadir una solución Na2S. Alternativamente, cisteína-HCl, tioglicolato de sodio, o ditonita de sodio se utilizan comúnmente. Sin embargo, qué agente reductor es apropiado utilizar depende de la configuración experimental respectiva y podría requerir una atención especial. Por ejemplo, el tioglicolato de sodio necesita activación de la temperatura (por ejemplo, mediante autoclave).
Un consorcio microbiano bien equilibrado, compuesto por varios géneros de bacterias y arqueas, y una cascada de degradación anaeróbica de trabajo eficiente se puede evaluar aún más determinando la composición del gas del espacio de la cabeza en los matraces de cultivo a través del gas Cromatografía. Al manipular compuestos como los fenilácidos derivados de diferentes precursores, la evaluación del espacio de la cabeza es una forma rápida de comprobar el proceso de metanogénesis8. Una concentración de CH4 en el espacio de cabeza de aprox. 50-60% en los controles al final del período de incubación indica una utilización exitosa de los nutrientes aplicados y por lo tanto una mineralización de material orgánico en condiciones anaeróbicas. La producción teórica de metano y las concentraciones de metano esperadas durante el proceso de digestión se pueden determinar ex ante de acuerdo con la ecuación Buswell-Boyle después del análisis elemental del sustrato o estimando el contenido de carbohidratos, proteínas y grasas en el sustrato. Según VDI 4630 15, los carbohidratos pueden conducir a una producción teórica de biogás de 750 L kg-1 VSS (50% CH4 y 50% CO2),proteínas a 800 L kg-1 VSS (72% CH4 y 28 % CO2),y grasas a 1.390 L kg -1 VSS (60% CH4 y 40% CO2).
Además, se monitoreó la formación y posible degradación posterior de los VFA y los fenilácidos. El proceso de degradación se puede evaluar mediante el análisis de las concentraciones de VFA (por ejemplo, acetato, propionato) en diferentes momentos. La acumulación de ácidos grasos de cadena corta como el acetato y/o propionato puede apuntar a alteraciones en la composición de la comunidad metanogénica y a una sobrecarga general del reactor. Sin embargo, una cascada de degradación microbiana bien equilibradapuede incluso hacer frente a concentraciones muy altas de VFA y acetato 9. Además, la relación acetato/propionato podría proporcionar más información sobre el estado general del reactor16. Sin embargo, hay muchos parámetros adecuados para la supervisión de procesos que deben seleccionarse de acuerdo con las hipótesis experimentales propuestas. En el ejemplo actual, las variables diana fueron las concentraciones de fenil (Figura6).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por el Fondo De Ciencia de Austria (FWF): números de proyecto P 29360 y P 29143. La publicación fue apoyada por Publikationsfonds der Universitét Innsbruck. Reconocemos en gran medida a la AIE.
Materials
| culture flasks (120 mL, N20) | Ochs, Germany | 102046 | |
| buty rubber septa (N20) | Ochs, Germany | 102049 | |
| aluminium caps (N20) | Ochs, Germany | 102050 | |
| N2 gas | Messer, Austria | purity 5.0 | |
| syringes + cannulae | various | ||
| crimper | Ochs, Germany | 102051 | |
| de-crimper | Ochs, Germany | 102052 | |
| GC2010 | Shimadzu | ||
| Shin-carbon GC column | Restek | chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2 | |
| HPLC Prominence | Shimadzu | ||
| Fast Fruit HPLC Column | Phenomenex | chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc. |
References
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