Средняя подготовка к культивированию микроорганизмов в строго анаэробных/аноксических условиях
Summary
Поскольку обязыванные анаэробные организмы не могут расти при воздействии кислорода, использование анаэробных методов культивирования является необходимым. Здесь мы демонстрируем простой и эффективный метод культивирования смешанной культуры, полученной из биогазового растения от подготовки средств массовой информации к газу и квантификации летучих жирных кислот.
Abstract
В отличие от аэробных организмов, строго анаэробные микроорганизмы требуют отсутствия кислорода и, как правило, низкий потенциал редокса для инициирования роста. Поскольку кислород вездесущ в воздухе,сохранение O 2-свободных условий во время всех этапов выращивания является сложной задачей, но необходимым условием для анаэробного культивирования. Представленный здесь протокол демонстрирует успешное выращивание анаэробной смешанной культуры, полученной из биогазового растения простым и недорогим методом. Точное описание всего аноксического процесса культивирования дается в том числе подготовка средств массовой информации, заполнение культивирования фляг, добавки с индикатором Redox и сокращение агентов, чтобы обеспечить низкий потенциал Redox, а также обмен headspace держать средства массовой информации, свободные от кислорода. Кроме того, представлен подробный обзор асептически изолирующих газовых плотных сывороточных флягов (с использованием стерильных шприцев и игл) и подходящих условий инкубации. В настоящем протоколе далее рассматриваются газовые и жидкие отборы для последующего анализа состава газа и концентраций летучих жирных кислот с использованием газовой хроматографии (ГК) и высокопроизводительной жидкой хроматографии (ГПЛК), соответственно, и расчет урожайности биогаза и метана с учетом идеального газового закона.
Introduction
На земле молекулярный кислород в заметных концентрациях доступен в областях, имеющих прямой контакт с атмосферой или в присутствии кислородных фототрофов. Среды, в которых отсутствует кислород, называются анаэробными. Тем не менее, преобразование энергии все еще возможно в анаэробных условиях через два различных метаболических процессов, брожения и анаэробного дыхания1.
В то время как организмы, проходящие аэробное дыхание используют кислород в качестве терминального приема электронов, анаэробное дыхание требует альтернативных электронных приемов, таких как нитрат или сульфат2. В так называемой «электронной башне» пары редокса организованы в соответствии с их потенциалом редокса, причем самые отрицательные расположены в верхней части (доноры электрона) и сильнейшие агенты окисления с положительным потенциалом редокса на дне (электронные приемы). Передача электронов между донорами и принимающими сторонами приводит к энергосбережению через так называемую дыхательную цепь, а электроны могут быть захвачены электронными приемотелями – чтобы остаться на картинке – на разных этажах башни. Тем самым, чем выше падение электронов через электронную башню, тем больше энергии может быть сохранено соответствующей реакцией. Таким образом, дыхание также возможно в анаэробных средах обитания, например, с redox пары в том числе No3–/NO2–, фумационная кислота / succinic кислоты, SO32-/H2S, S ‘/H2S, Mn (IV) / Mn (II ), Fe (III)/Fe (II)2,3. Во-первых, полученная энергия сохраняется в качестве мембранного потенциала, который впоследствии используется при фосфорилировании электронов для синтеза аденозин-трифосфата (АТФ) мембранно-связанным аТФ-синтазами. В отличие от аэробного дыхания, количество энергии, которое может быть сохранено анаэробным дыханием, может быть значительно уменьшено; однако, выход энергии большинств анаэробных дыханий все еще более высок сравненный к закваранжению,анаэробный путь консервации энергии в habitats нуждался кислороде и других принимать енота терминала 2.
Во время брожения богатые энергией органические субстраты деградируют до различных продуктов брожения, которые часто определяют название общего процесса, например, алкогольное брожение. В отличие от процессов дыхания, генерация АТФ во время брожения ограничивается фосфорилированием на уровне субстрата, во время которого фосфатная группа передается в аденозин-ди-фосфат (АДП) из богатого энергией фосфорилированного субстрата2. Ферментающие микроорганизмы играют центральную роль в анаэробной деградации органических веществ, поскольку они являются ключевыми игроками в распаде субстрата. Первичные продукты брожения, как органические кислоты, спирты, CO2, и H2, впоследствии могут быть использованы вторичными ферментирующих микроорганизмов для производства уксусной кислоты, CO2, и H2. Примерами для ферментации продуктов являются молочная кислота, различные летучие жирные кислоты (форми-, уксусно-, пропирионические-, бутирик-, валерианол, 2,3-бутандиол, ацетон и этанол.
Культивирование микроорганизмов в строго анаэробных условиях требует совершенно иных методов и оборудования по сравнению с культивированием аэробных организмов. В то время как кислородоустойчивые организмы часто культивируются на агарных блюдах, так называемых поверхностных культурах, это – за некоторыми исключениями – вряд ли возможно для строго анаэробных микроорганизмов. Таким образом, обогащение культур строго анаэробных микроорганизмов в основном установлены в жидком носителе, применяя культурные сосуды, запечатанные газонепроницаемой септойкой, которые обеспечивают бескислородную атмосферу headspace4,6, 7.
В настоящем описании протокола будут предусмотрены надлежащие методы выращивания целевых микроорганизмов смешанной популяции, полученные из анаэробного биогазового растения. Изоляция и культивирование чистых культур является еще более сложной задачей, но не является частью этой работы.
Здесь мы показываем процедуру выращивания анаэробного микробного сообщества на основе исследования, касающегося образования фенилкислот при анаэробном переваривании белково-белковых субстратов8. Микробное сообщество состояло из представителей всех четырех фаз анаэробного пищеварения: гидролиз, ацидогенез, ацетогенез и метаногенез. Минеральная соляная среда, дополненная источником углерода, редокс-индикатором,раствором витамина и микроэлемента, и редуксовым агентом, была применена 9. Среда была изменена с соответствующими белковых фенилкислотных прекурсоров субстратов8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важным и важным шагом в выращивании анаэробных микроорганизмов является обеспечение бескислородных условий в средствах выращивания и области головы колб. Индикатор, как resazurin может быть использован для косвенной проверки правильного анаэробного заполнения колбы. Resazurin является широко используемым красителем redox, как это недорогой, нетоксичный, и уже эффективны в низких дозах и короткие инкубационные раз 12. При включении в средства массовой информации, синий цвет resazurin сначала проходит необратимые шаг сокращения resorufin, который розовый при нейтральных значениях рН. Эта первая реакция может произойти, когда средства массовой информации нагреваются 13. Впоследствии ресоруфин сводится к бесцветной дигидроресоруфин в обратимой вторичной реакции(рисунок 7)12. Система resorufin/dihydroresorufin redox становится совершенно бесцветной при стандартном потенциале снижения окисления около Eh -110 мВ и становится розовым выше редокс-потенциала -51 mV 13.
Для дальнейшего снижения потенциала редокса, например, для облегчения роста метаногенных микроорганизмов, которые, как известно, требуют менее -200 мВ14,может быть добавлен раствор Na2S. Кроме того, обычно используются цистеин-HCl, тиогликолна натрия или дитионита натрия. Однако, какой редуктор подходит для использования, зависит от соответствующей экспериментальной установки и может потребовать особого внимания. Например, тиогликолят натрия нуждается в активации температуры (например, путем автоматического вскрытия).
Хорошо сбалансированный микробный консорциум, состоящий из различных родов бактерий и археев, и эффективно работающий анаэробный каскад деградации могут быть дополнительно оценены путем определения состава газа в области культуры с помощью газа Хроматографии. При обработке соединений, как фенилкислоты, полученные из различных прекурсоров, оценка головного пространства является быстрый способ проверить процесс метаногенеза8. Концентрация CH4 в области управления в конце инкубационного периода указывает на успешное использование прикладных питательных веществ и, таким образом, на минерализацию органического материала в анаэробных условиях. Теоретические производства метана и ожидаемые концентрации метана в процессе пищеварения могут быть определены ex ante в соответствии с уравнением Басвелла-Бойла после элементарного анализа субстрата или путем оценки содержания углеводы, белки и жиры в субстрате. Согласно VDI 4630 15,углеводы могут привести к теоретическому производству биогаза 750 л кг-1 VSS (50% CH4 и 50% CO 2), белков до 800 лкг -1 VSS (72% CH4 и 28% CO2),а жиры до 1390 л кг -1 VSS (60% CH4 и 40% CO2).
Кроме того, отслеживались образование и возможная последующая деградация ВФА и фениловых кислот. Процесс деградации можно оценить, проанализировав концентрации VFA (например, ацетат, пропионат) в разных точках времени. Накопление короткоцепочечных жирных кислот, таких как ацетат и/или пропионат, может указывать на нарушения в метаногенном составе сообщества и на общую перегрузку реактора. Однако хорошо сбалансированный каскад микробной деградации может даже справиться сочень высокой концентрацией VFA и ацетата 9. Кроме того, ацетат / пропионат соотношение может дополнительно предоставить информацию об общем состоянии реактора16. Однако существует много параметров, подходящих для мониторинга процессов, которые должны быть отобраны в соответствии с предлагаемыми экспериментальными гипотезами. В данном примере целевыми переменными были концентрации фениловой кислоты(рисунок 6).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Австрийским научным фондом (FWF): номеры проектов P 29360 и P 29143. Публикация была поддержана PublikationsFonds der Universit’t Innsbruck. Мы высоко ценим EIG.
Materials
| culture flasks (120 mL, N20) | Ochs, Germany | 102046 | |
| buty rubber septa (N20) | Ochs, Germany | 102049 | |
| aluminium caps (N20) | Ochs, Germany | 102050 | |
| N2 gas | Messer, Austria | purity 5.0 | |
| syringes + cannulae | various | ||
| crimper | Ochs, Germany | 102051 | |
| de-crimper | Ochs, Germany | 102052 | |
| GC2010 | Shimadzu | ||
| Shin-carbon GC column | Restek | chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2 | |
| HPLC Prominence | Shimadzu | ||
| Fast Fruit HPLC Column | Phenomenex | chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc. |
References
- Wiebe, W. J., Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G., et al. Anaerobic Respiration and Fermentation. The Ecology of a Salt Marsh. , 137-159 (1981).
- Kim, B. H., Gadd, G. M., Kim, B. H., Gadd, G. M. Anaerobic fermentation. Bacterial physiology and metabolism. , 252-297 (2008).
- Stolz, J. F., Oremland, R. S. Bacterial respiration of arsenic and selenium). FEMS Microbiology Reviews. 23 (5), 615-627 (1999).
- Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic Methanogenesis and Autotrophic Growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
- Mutschlechner, M., Praeg, N., Illmer, P. The ecological importance of grazing to methane fluxes and engaged microbial communities in alpine forest soils. FEMS Microbiology Ecology. , (2018).
- Prem, E. M., Reitschuler, C., Illmer, P. Livestock grazing on alpine soils causes changes in abiotic and biotic soil properties and thus in abundance and activity of microorganisms engaged in the methane cycle. European Journal of Soil Biology. 62, 22-29 (2014).
- Praeg, N., Wagner, A. O., Illmer, P. Effects of fertilisation, temperature and water content on microbial properties and methane production and methane oxidation in subalpine soils. European Journal of Soil Biology. 65, 96-106 (2014).
- Wagner, A. O., Prem, E. M., Markt, R., Kaufmann, R., Illmer, P. Formation of phenylacetic acid and phenylpropionic acid under different overload conditions during mesophilic and thermophilic anaerobic digestion. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 359 (2019).
- Lins, P., Malin, C., Wagner, A. O., Illmer, P. Reduction of accumulated volatile fatty acids by an acetate-degrading enrichment culture. FEMS Microbiology Ecology. 71 (3), 469-478 (2010).
- Wagner, A. O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. Effects of different nitrogen sources on the biogas production – a lab-scale investigation. Microbiological research. 167 (10), 630-636 (2012).
- Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
- Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds. Biomaterials. 129, 163-175 (2017).
- Costilow, R. N., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., et al. Physicochemical Factors in Growth. Methods for General and Molecular Microbiology. , 309-329 (2007).
- Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review. European Journal of Soil Biology. 37 (1), 25-50 (2001).
- . Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material. VDI Richtlinien. , (2006).
- Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
