הכנה בינונית לטיפוח מיקרואורגניזמים בתנאים אנאירובית/אנקסימית בלבד
Summary
כמו אורגניזמים אנאירובית מחייב אינם מסוגלים לצמוח על החשיפה לחמצן, השימוש של טכניקות culturing אנאירובית הוא הכרחי. כאן, אנו להדגים שיטה פשוטה ויעילה לטפח תרבות מעורבת נגזר צמח ביוגז מפני התקשורת הכנה גז וכימות חומצות שומן נדיף.
Abstract
בניגוד לאורגניזמים האירובית, מיקרואורגניזמים אנאירובית לחלוטין דורשים היעדר חמצן ובדרך כלל פוטנציאל נמוך החמצון ליזום צמיחה. כמו חמצן נמצא בכל מקום באוויר, שמירה על תנאי O2-חינם במהלך כל השלבים של הטיפוח הוא מאתגר, אבל תנאי מוקדם לקבלת culturing אנאירובית. הפרוטוקול המוצג כאן ממחיש את הטיפוח המוצלח של תרבות מעורבת אנאירובית הנגזרת מצמח ביוגז באמצעות שיטה פשוטה וזולה. תיאור מדויק של התהליך האנטומי כולו מוענק כולל הכנה למדיה, מילוי מבחנות, תוספת של מחוון חמצון והפחתת סוכנים כדי לספק פוטנציאל החמצון נמוך, כמו גם להחליף את החלל הקדמי כדי לשמור על תקשורת ללא חמצן. יתר על כן, סקירה מפורטת של aseptically מבחנות סרום הדוקה גז הדוק (באמצעות מזרקים ומחטים סטרילי) ותנאי דגירה מתאים מסופק. הפרוטוקול הנוכחי עוסק עוד יותר בדיגום גז ונוזלים לניתוחים הבאים לגבי הרכב גז וריכוזי חומצות שומן נדיפות באמצעות כרומטוגרפיה גז (GC) וביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (בהתאמה), וה חישוב של ביוגז ותשואה מתאן בהתחשב בחוק הגז האידיאלי.
Introduction
על חמצן מולקולרי כדור הארץ בריכוזים הבולטים זמין באזורים שיש להם קשר ישיר עם האטמוספירה או בנוכחות של פוטוגניים מחמצן. סביבות שבו החמצן נעדר נקראים אנאירובית. עם זאת, המרת אנרגיה היא עדיין אפשרית בתנאים אנאירובית באמצעות שני תהליכים מטבוליים שונים, תסיסה ונשימה אנאירובית1.
בעוד שאורגניזמים העוברים נשימה אירובית משתמשים בחמצן כקבלה אלקטרון מסוף, הנשימה אנאירובית דורשת מעבר אלקטרוני חלופי כמו חנקה או סולפט2. ב “מגדל האלקטרונים”, זוגות החמצון מאורגנים על פי הפוטנציאל החוזר שלהם, עם השליליות השלילית ביותר בחלק העליון (תורמים אלקטרונים) וסוכני חמצון החזקה ביותר עם פוטנציאל החמצון החיובי בתחתית (למועמדים אלקטרונים). העברת האלקטרונים בין התורמים והמועמדים מובילה לשימור האנרגיה דרך שרשרת הנשימה והאלקטרונים יכולים להילכד בידי מקבל האלקטרונים-להישאר בתמונה בקומות שונים של המגדל. ולכן, ככל שנפילת האלקטרונים באמצעות מגדל האלקטרונים גבוהה יותר, ניתן לטפל ביותר אנרגיה על-ידי התגובה המתאימה. לכן, נשימה אפשרית גם בבתי גידול אנאירובית, למשל, עם צמדי חמצון כולללא 3–/no2–, חומצה פומרית/חומצה סואית,אז 32-/H2S, s °/H2, Mn (IV)/mn (II ), Fe (III)/fe (II)2,3. ראשית, האנרגיה הנוצרת שימור כפוטנציאל ממברנה, אשר משמש לאחר מכן באמצעות זירחון התחבורה האלקטרונים של אדנוזין-triphosphate (ATP) סינתזה על ידי ממברנה הקשורות ATP-סטנדרטים. בניגוד לנשימה אירובית, כמות האנרגיה שניתן לשימור על ידי נשימה אנאירובית יכול להיות מופחת באופן דרמטי; עם זאת, תפוקת האנרגיה של מרבית הנשימות האנאירובית היא עדיין גבוהה יותר לעומת תסיסה, מסלול שימור אנרגיה אנאירובית בבתי הגידול החסרים חמצן ומסופי אלקטרון מסופים אחרים2.
במהלך התסיסה, מצעים אורגניים עתירי אנרגיה, מכוהים למוצרי תסיסה שונים, המגדירים לעתים קרובות את שם התהליך הכולל, למשל, תסיסה אלכוהוליסטית. בניגוד לתהליכי הנשימה, דור ה-ATP בזמן התסיסה מוגבל לזרחון ברמת המצע שבמהלכו מועברת קבוצת פוספט ל-אדנוזין-די-פוספט (ADP) ממצעזרחניעתיר אנרגיה. מיקרואורגניזמים הגדלת תפקיד מרכזי השפלה אנאירובית של חומר אורגני כפי שהם מפתח-שחקנים בהתמוטטות המצע. מוצרי התסיסה העיקריים, כמו חומצות אורגניות, אלכוהול, CO2, ו-H2, לאחר מכן ניתן להשתמש על ידי מיקרואורגניזמים משני הגדלת לייצר חומצה אצטית, CO2, ו-H2. דוגמאות למוצרי תסיסה כוללים חומצת חלב, חומצות שומן נדיפות שונות (formic-, אצטט-, propionic-, בוטירית-, חומצה valeric), n-butanol, 2, 3-butandiol, אצטון, ו אתנול.
טיפוח של מיקרואורגניזמים בתנאים אנאירובית לחלוטין דורש שיטות וציוד שונים לגמרי בהשוואה לטיפוח האורגניזמים האירוביים. בעוד אורגניזמים עמידים בפני חמצן מעובדים לעתים קרובות על מנות אגר, כביכול תרבויות פני השטח, זה-עם כמה חריגים-בקושי אפשרי עבור מיקרואורגניזמים אנאירובית לחלוטין. לפיכך, תרבויות העשרה של מיקרואורגניזמים אנאירובית לחלוטין מבוססים בעיקר במדיה נוזלית החלה בכלי התרבות האטומים עם septa גז המבטיחים אווירה של חלל ראש נקי מחמצן4,6, 7. לאחר מכן
תיאור הפרוטוקול הנוכחי יספק שיטות הטיפוח המתאימות למיקרואורגניזמים היעד של אוכלוסיה מעורבת הנגזרת מצמח אניוגז אירובי. הבידוד והטיפוח של תרבויות טהורות הוא אפילו יותר מאתגר, אבל לא חלק מהעבודה הזאת.
כאן, אנו מראים את ההליך לטיפוח הקהילה מיקרוביאלית אנאירובית מבוסס על מחקר לגבי היווצרות חומצות פנקסיל במהלך העיכול אנאירובית של מצעים הפרוטטינופה8. קהילת החיידקים מורכבת מחברים מכל ארבעת השלבים של העיכול האנאירובי: הידרוליזה, אקאיגנזה, אספטוגנזה ומתיאנוגנזה. בינוני מלח מינרלים בתוספת עם מקור פחמן, החמצון מחוון, ויטמין ורכיב מעקב פתרון, והפחתת הסוכן הוחל9. המדיום תוקן עם המתאים ביותר חומצה הפרוטאינאכאיל הבשר מצעיםשמונה 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצעד החשוב והקריטי ביותר ב culturing מיקרואורגניזמים אנאירובית היא להבטיח מצבים ללא חמצן בעיבוד המדיה ומרחב הראש של בקבוקי. מחוון כמו resazurin יכול לשמש בעקיפין לבדוק את המילוי אנאירובית הנכון של מבחנות. Resazurin הוא צבע שימוש נפוץ החמצון כפי שהוא זול, לא רעיל, והוא כבר יעיל במינונים נמוכים הדגירה קצר פעמים 12. כאשר משולבים בתקשורת, הצבע הכחול resazurin הראשון עובר צעד הפחתה בלתי הפיך לספיגה, אשר הוא ורוד בערכי ה-pH נייטרלי. תגובה ראשונה זו יכולה להתרחש כאשר המדיה מחוממת 13. לאחר מכן, הריאופין מופחת לסטייה חסרת צבע בתגובה משנית הפיכה (איור 7)12. המערכת מחדש הופך לחסר צבע לחלוטין בפוטנציאל הפחתת חמצון רגיל של אודות Eh =-110 mv והופך ורוד מעל פוטנציאל החמצון של-51 mV 13.
על מנת לצמצם עוד יותר את הפוטנציאל לחמצון, למשל, כדי להקל על הצמיחה של מיקרואורגניזמים מתיונין ידוע לדרוש פחות מ-200 mV14, פתרון Na2S ניתן להוסיף. לחילופין, cysteine-HCl, נתרן-תאיוגליקוליום, או נתרן דיתיוניט משמשים בדרך כלל. עם זאת, אשר הפחתת הסוכן מתאים לשימוש תלוי בכיוונון ניסיוני בהתאמה והוא עשוי לדרוש תשומת לב מיוחדת. למשל, נתרן thioglycolate צריך הפעלת טמפרטורה (למשל, על ידי אוטוקלינג).
חיידקים מאוזנים היטב, המורכב מסוגים שונים של חיידקים והארכאונים, והוא עובד ביעילות השפלה אנאירובית מדורגת ניתן עוד להעריך על ידי קביעת הרכב החלל הקדמי גז בצלוחיות התרבות באמצעות גז כרומטוגרפיה. כאשר הטיפול תרכובות כמו חומצות פנקסיל הנגזרות precursors שונים, הערכה של החלל הקדמי היא דרך מהירה כדי לבדוק את התהליך של מתיונין8. מרחב אמות4 ריכוז של כ. 50-60% בפקדים בסוף תקופת הדגירה מצביע על ניצול מוצלח של החומרים המזינים שהוחלו ולכן מינרליזציה של חומר אורגני בתנאים אנאירובית. הפקת מתאן תיאורטית וריכוזי מתאן במהלך תהליך העיכול ניתן לקבוע לאחר מכן על פי משוואת buswell-בויל לאחר ניתוח יסודי של המצע או על ידי הערכת התוכן של פחמימות, חלבונים ושומנים במצע. על פי VDI 4630 15, פחמימות יכול להוביל לייצור ביוגז תיאורטי של 750 L kg-1 VSS (50% CH4 ו 50% CO2), חלבונים עד 800 L ק”ג-1 VSS (72% CH4 ו 28% CO2), ו שומנים כדי 1,390 L ק ג . אני לא מבין VSS (60% CH ‘4 ו 40% CO2).
יתר על כן, היווצרות אפשרי השפלה הבאים של VFAs וחומצות פנקסיל היו מנוטרים. תהליך ההשפלה ניתן להעריך על ידי ניתוח של ריכוזי VFA (למשל, אצטט, propionate) בנקודות זמן שונות. הצטברות חומצות שומן קצרות כמו אצטט ו/או propionate יכול להצביע על הפרעות בקומפוזיציה הקהילה methanogenic לבין עומס יתר המגיב הכולל. עם זאת, מאוזן מאוזנת השפלה מיקרוביאלית יכול אפילו להתמודד עם VFA גבוהה מאוד ריכוזי אצטט9. חוץ מזה, יחס אצטט/propionate עשוי לספק עוד מידע על תנאי המחולל הכולל16. עם זאת, ישנם פרמטרים רבים המתאימים לניטור תהליך כי יש לבחור על פי השערות ניסיוני המוצע. בדוגמה הנוכחית, משתני היעד היו בריכוזים של חומצה פניקסיל (איור 6).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF): מספרי הפרוייקט P 29360 ו-P 29143. הפרסום נתמך על ידי בעלי ההון באוניברסיטת אינסברוק. אנו מכירים במידה רבה את EIG.
Materials
| culture flasks (120 mL, N20) | Ochs, Germany | 102046 | |
| buty rubber septa (N20) | Ochs, Germany | 102049 | |
| aluminium caps (N20) | Ochs, Germany | 102050 | |
| N2 gas | Messer, Austria | purity 5.0 | |
| syringes + cannulae | various | ||
| crimper | Ochs, Germany | 102051 | |
| de-crimper | Ochs, Germany | 102052 | |
| GC2010 | Shimadzu | ||
| Shin-carbon GC column | Restek | chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2 | |
| HPLC Prominence | Shimadzu | ||
| Fast Fruit HPLC Column | Phenomenex | chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc. |
References
- Wiebe, W. J., Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G., et al. Anaerobic Respiration and Fermentation. The Ecology of a Salt Marsh. , 137-159 (1981).
- Kim, B. H., Gadd, G. M., Kim, B. H., Gadd, G. M. Anaerobic fermentation. Bacterial physiology and metabolism. , 252-297 (2008).
- Stolz, J. F., Oremland, R. S. Bacterial respiration of arsenic and selenium). FEMS Microbiology Reviews. 23 (5), 615-627 (1999).
- Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic Methanogenesis and Autotrophic Growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
- Mutschlechner, M., Praeg, N., Illmer, P. The ecological importance of grazing to methane fluxes and engaged microbial communities in alpine forest soils. FEMS Microbiology Ecology. , (2018).
- Prem, E. M., Reitschuler, C., Illmer, P. Livestock grazing on alpine soils causes changes in abiotic and biotic soil properties and thus in abundance and activity of microorganisms engaged in the methane cycle. European Journal of Soil Biology. 62, 22-29 (2014).
- Praeg, N., Wagner, A. O., Illmer, P. Effects of fertilisation, temperature and water content on microbial properties and methane production and methane oxidation in subalpine soils. European Journal of Soil Biology. 65, 96-106 (2014).
- Wagner, A. O., Prem, E. M., Markt, R., Kaufmann, R., Illmer, P. Formation of phenylacetic acid and phenylpropionic acid under different overload conditions during mesophilic and thermophilic anaerobic digestion. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 359 (2019).
- Lins, P., Malin, C., Wagner, A. O., Illmer, P. Reduction of accumulated volatile fatty acids by an acetate-degrading enrichment culture. FEMS Microbiology Ecology. 71 (3), 469-478 (2010).
- Wagner, A. O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. Effects of different nitrogen sources on the biogas production – a lab-scale investigation. Microbiological research. 167 (10), 630-636 (2012).
- Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
- Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds. Biomaterials. 129, 163-175 (2017).
- Costilow, R. N., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., et al. Physicochemical Factors in Growth. Methods for General and Molecular Microbiology. , 309-329 (2007).
- Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review. European Journal of Soil Biology. 37 (1), 25-50 (2001).
- . Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material. VDI Richtlinien. , (2006).
- Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
