JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Middelgrote voorbereiding voor de teelt van micro-organismen onder strikt anaerobe/anoxische condities

Published: August 15, 2019
doi:
10.3791/60155
, , , , , ,
1Department of Microbiology,Universität Innsbruck

Summary

Zoals de verplicht anaerobe organismen niet kunnen groeien bij zuurstof blootstelling, is het gebruik van anaerobe kweektechnieken onontbeerlijk. Hier tonen we een eenvoudige en effectieve methode om een gemengde cultuur te cultiveren die is afgeleid van een biogasinstallatie van media voorbereiding tot gas en vluchtige vetzuur kwantificering.

Abstract

In tegenstelling tot aërobe organismen, strikt anaerobe micro-organismen vereisen de afwezigheid van zuurstof en meestal een lage redox potentieel om groei te initiëren. Omdat zuurstof alomtegenwoordig is in de lucht, is het vasthouden van2-vrije condities tijdens alle stappen van de teelt uitdagend, maar een voorwaarde voor anaerobe kweek. Het hier gepresenteerde protocol toont de succesvolle teelt van een anaerobe gemengde cultuur, afgeleid van een biogasinstallatie, met behulp van een eenvoudige en goedkope methode. Een precieze beschrijving van het gehele anoxische kweekproces wordt gegeven, inclusief media voorbereiding, vulling van kweek kolven, suppletie met redox-indicator en reducerende middelen om lage redox potentialen te bieden, evenals het uitwisselen van de headspace om media vrij van zuurstof. Verder wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van het aseptisch inoculeren van gasdichte serum kolven (door gebruik te maken van steriele spuiten en naalden) en geschikte incubatie condities. Dit protocol behandelt verder de bemonstering van gas en vloeistoffen voor latere analyses met betrekking tot de gassamenstelling en de vluchtige vetzuur concentraties met behulp van gaschromatografie (GC) en hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), en de berekening van biogas-en methaan opbrengst gezien de ideale gaswet.

Introduction

Op aarde moleculaire zuurstof in opmerkelijke concentraties is beschikbaar in gebieden met direct contact met de atmosfeer of in de aanwezigheid van Oxygene fototrophs. Omgevingen waarin zuurstof ontbreekt worden anaerobe genoemd. Echter, Energieconversie is nog steeds mogelijk onder anaerobe condities via twee verschillende metabole processen, fermentatie en anaerobe ademhaling1.

Terwijl organismen die aërobe ademhaling ondergaan zuurstof gebruiken als een terminale elektron acceptor, vereist anaerobe ademhaling alternatieve elektron acceptoren zoals nitraat of sulfaat2. In de zogenoemde “elektronen toren” worden redox koppels georganiseerd volgens hun redoxpotentiaal, met de meest negatieve aan de top (elektron donoren) en de sterkste oxidatiemiddelen met positieve redoxpotentiaal onderaan (elektron acceptors). De elektron overdracht tussen donoren en accepteurs leidt tot energiebesparing via de zogenaamde Ademhalings keten en elektronen kunnen worden opgevangen door elektronen acceptoren-om in de foto te blijven-in verschillende verdiepingen van de toren. Daardoor, hoe hoger de val van elektronen door de elektronen toren, hoe meer energie kan worden behouden door de respectieve reactie. Daarom is ademhaling ook mogelijk in anaerobe habitats, bijvoorbeeld met redox paren, waaronder geen3–/No2–, fumarinezuur/BARNSTEENZUUR, dus32-/u2s, s °/u2s, MN (IV)/mn (II ), Fe (III)/Fe (II)2,3. Eerste, de resulterende energie wordt bewaard als membraanpotentiaal, die vervolgens wordt gebruikt door elektron transport fosforylering voor adenosine-trifosfaat (ATP) synthese door membraan gebonden ATP-synthases. In tegenstelling tot aërobe ademhaling, de hoeveelheid energie die kan worden bewaard door anaerobe ademhaling kan drastisch worden verminderd; echter, de energie-output van de meeste anaerobe ademhaling is nog steeds hoger in vergelijking met fermentatie, een anaerobe energiebeschermingsweg in habitats die geen zuurstof en andere terminale elektron acceptoren2.

Tijdens de fermentatie worden energierijke, organische substraten afgebroken tot verschillende fermentatie producten die vaak de naam van het totale proces definiëren, bijvoorbeeld alcoholische fermentatie. In tegenstelling tot Ademhalings processen is de ATP-generatie tijdens de fermentatie beperkt tot substraat niveau fosforylering waarbij een fosfaatgroep wordt overgebracht naar adenosine-di-fosfaat (ADP) van een energierijke fosforyleerd substraat2. Het fermenteren van micro-organismen speelt een centrale rol bij de anaerobe afbraak van organisch materiaal, omdat het belangrijke spelers in de substraat afbraak zijn. De primaire fermentatie producten, zoals organische zuren, alcoholen, CO2en h2, kunnen vervolgens worden gebruikt door secundaire fermenterende micro-organismen om azijnzuur, co2en h2te produceren. Voorbeelden van fermentatie producten zijn melkzuur, verschillende vluchtige vetzuren (mieren-, azijnzuur-, propion-, Butyric-, valerische zuren), n-butanol, 2, 3-butandiol, aceton en ethanol.

De teelt van micro-organismen onder strikt anaerobe omstandigheden vereist totaal verschillende methoden en apparatuur in vergelijking met de teelt van aërobe organismen. Terwijl zuurstof tolerante organismen vaak worden gekweekt op agar-gerechten, zogenaamde oppervlakte culturen, is dit-met een paar uitzonderingen-nauwelijks mogelijk voor strikt anaerobe micro-organismen. Daarom worden verrijkings culturen van strikt anaerobe micro-organismen voornamelijk vastgesteld in vloeibare media die kweekvaten met gasdichte septa aanbrengen die een zuurstofvrije ruimteatmosfeer van4,6, 7.

De huidige protocol beschrijving voorziet in passende teeltmethoden voor doel-micro-organismen van een gemengde populatie die afkomstig zijn van een anaerobe biogasinstallatie. De isolatie en teelt van zuivere culturen is nog uitdagender, maar maakt geen deel uit van dit werk.

Hier tonen we de procedure voor het cultiveren van een anaerobe microbiële Gemeenschap op basis van een studie over de vorming van fenylzuren tijdens anaerobe vergisting van Proteïnurie8. De microbiële Gemeenschap bestond uit leden uit alle vier fasen van anaerobe vergisting: hydrolyse, acidogenese, acetogenese en methanogenese. Een mineraal zout medium aangevuld met een koolstofbron, redox-indicator, vitamine-en spoorelement oplossing en reduceermiddel werd toegepast9. Het medium werd gewijzigd met de respectieve proteinaceeuze fenyl zuur precursor substraten8.

Protocol

1. bereiding van de middel Bereiding redox indicator Stock Solution (0,1 g resazurin/100 mL waterige oplossing). Bereid vitamine oplossing (tabel 1). Traceer element oplossing voorbereiden (tabel 2).Opmerking: de volgorde van optellen is belangrijk; Raadpleeg tabel 2 en de respectieve protocollen. Bereid reductie agent Stock Solution (60 g na2S/L waterige oplossing). Weeg middelmatige ingrediënten (mineraal zout medium, tabel 3) in een geschikte kolf (bijv. een schroefdop laboratorium kolf van 1 L).Opmerking: afhankelijk van de experimentele instellingen kan het nodig zijn de toevoeging van een afzonderlijke koolstofbron te doen. Voeg half volume gedistilleerd water toe (tabel 3) en los de ingrediënten op. Voeg 1 mL redox-indicatoroplossing toe volgens tabel 3. Voeg vitamine-en spoorelement-oplossing toe volgens tabel 3. Pas de pH aan volgens de eisen van het medium/organisme in tabel 3.Opmerking: de kleur van de redox-indicator is pH-afhankelijk en kan enige tijd nodig hebben om aan te passen. Breng tot een eindvolume van 1 L met gedestilleerd water.Opmerking: vitamine-en spoorelement oplossingen kunnen ook na Autoclaveren worden toegevoegd door aseptisch een filter gesteriliseerde aliquot (verdunde oplossingen, filter poriegrootte < 0,2 μm) toe te voegen aan eerder gesloten en geautoclaveerd serum kolven. Deze aanpak draagt echter een verhoogd risico op verontreiniging. 2. vulling van de kweek kolven Grondig reinigen en drogen van 120 mL serum kolven.Opmerking: serum kolven zijn verkrijgbaar in verschillende volume capaciteiten (bijv. 20, 60, 120, 250 mL). Grondig schoon en droog butylrubber septa. Weeg extra medium componenten (bijv. fenyl zuur precursor substraten) in de kweek kolven af.Opmerking: aanvullende componenten zijn afhankelijk van experimentele instellingen en hypothese. Vul de serum kolven met 50 mL medium. 3. vermindering/verwijdering van zuurstof in de vloeibare fase Maak een ~ 100 ° C waterbad. Zet gevulde serum kolven in het waterbad en inbroed ca. 20-30 min om de oplosbaarheid van O2 in de vloeistoffase te verminderen. Spoel de headspace onmiddellijk met N2 gas of als alternatief met andere gas-of gasmengsels zoals n2/co2.Let op: zorg voor de juiste ventilatie van de ruimte. Sluit de kolven met butylrubberen septa en bevestig met aluminium doppen.Let op: rubber septa kan vaak beter op de nek van de kolf passen door een druppel water/medium toe te voegen tijdens het boren. Voeg 0,1 mL reduceermiddel (stamoplossing) toe aan elke kolf gevuld met 50 mL medium om de redoxpotentiaal verder te verminderen (0,1 mL reductiemiddel per 50 mL medium). Autoclaaf gedurende 20 min bij 121 °C.Let op: er moet een autoclaaf gecertificeerd worden voor het steriliseren van gesloten vaten. Anders kan de overdruk die is afgeleid van de temperatuurstijging leiden tot een explosie van serum kolven. 4. inoculatie van het medium Bereid entmateriaal van anaerobe digester. Voeg 400 mL gedestilleerd water in een kolf toe en breng het aan de kook. Koel het af (< 30 °C) en spoel de hoofdruimte permanent door met N2. Voeg ca. 100 g slib toe dat is afgeleid van een anaerobe digester.Opmerking: vermijd overmatig contact van slib met zuurstof. Noteer de exacte massa van het toegevoegde slib voor de precieze bepaling van de verdunning. Wissel de hoofdruimte van de kolf uit met N2 en sluit deze af met een tussenschot van butylrubber. Schud de kolf gedurende 30 minuten bij 120 rpm. Verwijder 5 mL entmateriaal met behulp van de spuit + canule en Injecteer het in bereide serum kolven zoals beschreven in stap 1-3. 5. incubatie, bemonstering en analyse Geïnculeerde serum kolven op een temperatuur die geschikt is voor het desbetreffende experiment.Opmerking: de incubatietemperatuur is afhankelijk van de experimentele opzet en het gebruikte entmateriaal. Afvoer overdruk als gevolg van de temperatuurstijging met behulp van spuit + canule, wanneer de vloeistof in de serum kolven is geëscaleerd tot incubatietemperatuur (ongeveer 15 – 30 min, afhankelijk van de incubatietemperatuur).Let op: afhankelijk van het toegepaste substraat kunnen de concentratie, temperatuur, incubatietijd, entmateriaal type en concentratie, overdruk binnen kolven oplopen tot > 2 bar druk en kunnen de serum flaks exploderen. Het bewaken van de overdruk met behulp van een manometer en vervolgens het aftappen van overdruk met een canule is daarom verplicht. Evalueer de productie en samenstelling van biogas tijdens de incubatietijd.Opmerking: incubatietijd kan enkele dagen tot enkele weken duren. Huidige atmosferische druk vastleggen. Maak een manometer en evalueer de druk in de kolven die zijn afgeleid van microbiële activiteit. Schud de kolven. Verwijder 1 mL headspace-gas met behulp van een spuit + canule en meet de concentraties H2, O2, CH4en/of co2 via gaschromatografie.Opmerking: voor de kwalificatie en kwantificering van H2, O2, CH4en co2 werd een gaschromatograaf gebruikt met gebruik van bedrijfstemperaturen van 160 °c (kolomoven), 100 °c (injector) en 180 °C (thermische geleidbaarheids detector, tcd ). N2 werd gebruikt als draaggas. Voor meer informatie, zie vorige studies10. Controleer concentraties van vluchtige vetzuren (VFA) en fenyl-zuren. Gebruik voor VFA-en fenylzuuranalyse een HPLC-systeem dat is uitgerust met een UV-detector (bij 220 nm) met 5 mM H2, dus4 als mobiele fase. Voor de details van de methode en aanvullende informatie over de opslag van monsters, zie de vorige onderzoeken11.NB: de analyse van VFA is voorbeeldig voor vele andere fysisch-chemische analyses of microscopische evaluaties. Bovendien kunnen moleculaire biologische methoden die gericht zijn op de overvloed aan specifieke micro-organismen en/of samenstelling van de microbiële Gemeenschap op een bepaald punt van het experiment, worden toegepast met behulp van de beschreven procedure. Verwijder 1 mL vloeistof met spuit + canule.Opmerking: monsters kunnen worden bevroren (-20 °C) onmiddellijk na intrekking en geanalyseerd aan het einde van het experiment11. Centrifugeer bij 15000 – 20000 x g en passeren 0,2 μm RC (geregenereerde cellulose) filters. Injecteer 5-20 μL op een HPLC-systeem en analyseer de VFA-samenstelling en concentratie van fenyl-zuren. Overdruk van de afvoer kolf met behulp van een canule.Opmerking: plaats de kweek kolf na het bepalen van de druk-en gassamenstelling en het nemen van het benodigde monster terug op de respectieve temperatuur en laat de overdruk niet lopen voordat de vloeistof de incubatietemperatuur heeft bereikt. Bereken biogas-en methaanproductie VCH4N rekening houdend met de ideale gaswet met behulp van vergelijking 1-3. Zie ook tabel 4.Vergelijking 1:WaarbijVergelijking 2:EnVergelijking 3:Opmerking: voor de berekening van de totale biogasproductie moet de hoeveelheid CH4% en CH4% X in vergelijking 2 en 3 worden ingesteld op 100. NmL: genormaliseerd gasvolume onder gestandaardiseerde omstandigheden (0 °C, 1 ATM), waaronder het molaire gasvolume 22,414 NmL/mmol is.

Representative Results

De kweek kolven werden gevuld met medium onder anaerobe condities volgens het hierboven beschreven protocol, gecontroleerd op de juiste kleur (Figuur 1) en worden gebruikt als miniatuur batch bioreactoren die anaerobe vergisting uitvoeren. Deze werden gewijzigd met substraten die mogelijk fenyl-zure vorming veroorzaakten en geïnineerd met behulp van anaerobe vergister slib als entmateriaal (Figuur 2). Tryptofaan, tyrosine, en fenylalanine, evenals de complexe proteinaceeuze precursor vleesextract en caseïne werden toegepast in twee en drie verschillende concentraties, respectievelijk. Controles werden bereid zonder extra substraat suppletie. Verschillende substraat concentraties gericht op de simulatie van verschillende stadia van overbelasting. Kolven werden gedurende 4 weken bij 37 °C (mesophilisch) geïnineerd. De productie en samenstelling van biogas (H2, CH4, co2) werd regelmatig gecontroleerd via GASCHROMATOGRAFIE (GC tcd)10 en evaluatie van de hoofdruimte druk. Figuur 3 toont de verschillen in de cumulatieve methaanproductie, afgeleid van de vertering van de toegepaste substraten in verschillende concentraties gedurende 4 weken anaerobe incubatie. Behalve, methanogenen werden gevisualiseerd door bestraling van het co-enzym F420, een elektron drager in de methanogenese, exposeren een blauw-groene fluorescentie met een absorptiemaximum bij 420 nm (Figuur 4). Gelijktijdig met de gasanalyse werden monsters voor VFA en fenylzuurconcentratie metingen via HPLC11 ingetrokken en bevroren opgeslagen tot verdere verwerking. Figuur 5 toont het effect van verschillende stadia van overbelasting, zoals weergegeven door een accumulatie in hoog overbelaste monsters die voor acetaat worden afgebeeld. Figuur 6 toont de dynamiek van fenyl acetaat concentraties tijdens de incubatieperiode. Figuur 1: redox-indicator. De juiste redoxpotentiaal in de kweek kolven kan worden geregeld door een Redox indicator toe te voegen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: miniatuur batch bioreactoren. Miniatuur batch bioreactoren bereid in 120 mL teelt kolven voor anaerobe vergistings experimenten. Kolven waren gevuld met medium en geënt met verdund vergister slib. De reactoren waren gasdicht afgesloten met butylrubberen stoppers en aluminium doppen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: methaanproductie. Cumulatieve methaanproductie gedurende 28 dagen van mesofische incubatie van reactoren die verschillende overbelastingscondities weerspiegelen (laag, gemiddeld, hoog). CONT: controle; Tryp: tryptofaan; Tyr: tyrosine; PHE: fenylalanine; ME: vleesextract; CAS: caseïne. Dit is een gemodificeerde figuur uit een eerdere studie8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: fluorescerende methanogenen. Methanogens stoten een blauwachtig licht uit wanneer ze opgewonden zijn met UV-licht. Hier worden methanogenen bevestigd aan planten deeltjes (licht groen). Monsters werden genomen uit een batch reactor, verdund voor microscopie, en onmiddellijk geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: acetaat concentratie. Acetaat concentratie gedurende 28 dagen van mesofische incubatie in reactoren die verschillende overbelastingscondities weerspiegelen (laag, gemiddeld, hoog). CONT: controle; Tryp: tryptofaan; Tyr: tyrosine; PHE: fenylalanine; ME: vleesextract; CAS: caseïne. Dit is een gemodificeerde figuur uit een eerdere studie8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 6: Fenylacetaat-concentratie. Fenylacetaat-concentratie gedurende 28 dagen van mesofische incubatie in reactoren die verschillende overbelastingscondities weerspiegelen (laag, gemiddeld, hoog). CONT: controle; Tryp: tryptofaan; Tyr: tyrosine; PHE: fenylalanine; ME: vleesextract; CAS: caseïne. Dit is een gemodificeerde figuur uit een eerdere studie8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 7: Resazurin-reactie. Blauw gekleurde resazurin ondergaat een onomkeerbare reductie naar resorufin (roze) en een verdere reversibele reductie naar de kleurloze dihydroresorufin volgens Uzarski et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Cyanocobalamine 0,050 g 4-aminobenzoinezuur 0,050 g D-Biotine 0,010 g Nicotininezuur 0,100 g Pyridoxine 0,250 g D-Pantotheenzuur 0,025 g Thiaminium chloride HCl 0,18 g Gedistilleerd water 1000 mL Tabel 1: Vitamine oplossing. 25% (w/v) HCl 10,0 mL FeCl2 x 4 H2O 1,50 g ZnCl2 0,070 g MnCl2 x 4 H2O 0,100 g H3Bo3 0,006 g CoCl2 x 6 H2O 0,190 g CuCl2 x 2 H2O 0,002 g NiCl2 x 6 H2O 0,024 g Na2Moo4 x 2 H2O 0,036 g Gedistilleerd water 990,0 mL Voorbereiding aanbeveling Voeg HCl toe en los FeCl2op, voeg 100 ml gedestilleerd water toe, Los de andere ingrediënten op en maak tot 1000 ml. Tabel 2: oplossing voor spoorelementen. Nacl 1,0 g MgCl2 x 6 H2O 0,4 g KH2po4 0,2 g Kcl 0,5 g CaCl2 x 2 H2O 0,15 g L-cysteïne 0,5 g Gistextract 1,0 g Resazurin oplossing 1 mL Vitamine oplossing 1 mL Oplossing voor spoorelementen 1 mL Gedistilleerd water 1000 mL Ph 7,2 Tabel 3: minimaal zout medium. Variabele Eenheid Beschrijving tY d Tijdspunt van meting tX d Tijdpunt van voorgaande meting pM mbar Gemeten overdruk bij tY pA mbar Omgevingsdruk bij tY pAX mbar Omgevingsdruk bij tX pS mbar Standaarddruk, 1013, 25 mbar acc. DIN 1343 TI K Incubatietemperatuur TS K Standaardtemperatuur, 273, 15 K (komt overeen met 0 ° C) volgens DIN 1343 VH ml Headspace volume bij tY VHX ml Headspace-volume bij tX CH4% [vol%] Methaan concentratie volgens GC-meting bij tY CH4% X [vol%] Methaan concentratie volgens GC-meting bij tX VCH4T Nml Totale hoeveelheid methaan in de serum fles bij tY VCH4R Nml Residueel methaan bedrag in de headspace bij tX VCH4N Nml Nieuw geproduceerd methaan van tX tot tY Tabel 4: beschrijving van de variabelen in vergelijking 1-3.

Discussion

De belangrijkste en cruciale stap in het kweken van anaerobe micro-organismen is het garanderen van zuurstofvrije omstandigheden in de kweekmedia en de headspace van de kolven. Een indicator zoals resazurin kan worden gebruikt om indirect de juiste anaerobe vulling van de kolven te controleren. Resazurin is een veelgebruikte redox-kleurstof omdat het goedkoop, niet-toxisch, en al effectief in lage doses en korte incubatietijd 12. Wanneer opgenomen in de media, de blauwe gekleurde resazurin eerst ondergaat een onomkeerbare reductie stap naar resorufin, die roze met neutrale pH-waarden is. Deze eerste reactie kan optreden wanneer de media worden verwarmd 13. Vervolgens wordt resorufin gereduceerd tot kleurloze dihydroresorufin in een omkeerbare secundaire reactie (Figuur 7)12. Het resorufin/dihydroresorufin redox-systeem wordt volledig kleurloos bij een standaard oxidatie-reductie potentiaal van ongeveer Eh =-110 MV en wordt roze boven een redoxpotentiaal van-51 MV 13.

Om de redoxpotentiaal verder te verminderen, bijvoorbeeld om de groei van methanogene micro-organismen te bevorderen waarvan bekend is dat ze minder dan-200 mV14nodig hebben, kan een na2S-oplossing worden toegevoegd. Als alternatief, cysteïne-HCl, natrium-thioglycolate, of natriumdithioniet worden vaak gebruikt. Echter, welke reducerende agent is geschikt voor gebruik is afhankelijk van de respectieve experimentele Setup en kan speciale aandacht vereisen. Natriumthioglycolaat heeft bijvoorbeeld temperatuur activatie nodig (bijv. door autoclaven).

Een goed uitgebalanceerd microbieel consortium, bestaande uit verschillende geslachten van bacteriën en archaea, en een efficiënt werkende anaerobe afbraak Cascade kunnen verder worden geëvalueerd door het bepalen van de headspace-gassamenstelling in de cultuur kolven via gas Chromatografie. Bij het hanteren van verbindingen zoals fenyl-zuren afgeleid van verschillende precursoren, de beoordeling van de headspace is een snelle manier om te controleren van de methaanvorming proces8. Een headspace CH4 -concentratie van ca. 50-60% in de controles aan het einde van de incubatieperiode duidt op een succesvolle benutting van de toegepaste nutriënten en dus een mineralisatie van organisch materiaal onder anaerobe condities. De theoretische methaanproductie en de expectable methaan concentraties tijdens het verteringsproces kunnen ex ante worden bepaald volgens de buswell-Boyle vergelijking na elementaire analyse van het substraat of door het inschatten van de inhoud van koolhydraten, eiwitten en vetten in het substraat. Volgens VDI 4630 15kunnen koolhydraten leiden tot een theoretische biogasproductie van 750 L kg-1 VSS (50% CH4 en 50% CO2), eiwitten tot 800 l kg-1 VSS (72% CH4 en 28% co2), en vetten tot 1.390 l kg -1- VSS (60% CH4 en 40% co2).

Bovendien werden de vorming en de mogelijke daaropvolgende afbraak van VFAs en fenyl zuren gemonitord. Het afbraakproces kan worden geëvalueerd door de VFA-concentraties (bijv. acetaat, propionaat) op verschillende tijdstippen te analyseren. Accumulatie van korte-keten vetzuren zoals acetaat en/of propionaat kan wijzen op verstoringen in de methanogene samenstelling van de Gemeenschap en op een algehele overbelasting van de reactor. Echter, een evenwichtige microbiële degradatie Cascade kan zelfs omgaan met zeer hoge VFA en acetaat concentraties9. Bovendien kan de acetaat/propionaat-verhouding verder informatie verschaffen over de algehele reactor conditie16. Er zijn echter veel parameters geschikt voor procesbewaking die moeten worden geselecteerd volgens de voorgestelde experimentele hypotheses. In het onderhavige voorbeeld waren de doelvariabelen Fenylzuur concentraties (Figuur 6).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Oostenrijkse wetenschaps Fonds (FWF): projectnummers P 29360 en P 29143. Publicatie werd ondersteund door Publikationsfonds der Universität Innsbruck. We erkennen EIG enorm.

Materials

culture flasks (120 mL, N20) Ochs, Germany 102046
buty rubber septa (N20) Ochs, Germany 102049
aluminium caps (N20) Ochs, Germany 102050
N2 gas Messer, Austria purity 5.0
syringes + cannulae various
crimper Ochs, Germany 102051
de-crimper Ochs, Germany 102052
GC2010 Shimadzu
Shin-carbon GC column Restek chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2
HPLC Prominence Shimadzu
Fast Fruit HPLC Column Phenomenex chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiebe, W. J., Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G., et al. Anaerobic Respiration and Fermentation. The Ecology of a Salt Marsh. , 137-159 (1981).
  2. Kim, B. H., Gadd, G. M., Kim, B. H., Gadd, G. M. Anaerobic fermentation. Bacterial physiology and metabolism. , 252-297 (2008).
  3. Stolz, J. F., Oremland, R. S. Bacterial respiration of arsenic and selenium). FEMS Microbiology Reviews. 23 (5), 615-627 (1999).
  4. Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic Methanogenesis and Autotrophic Growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
  5. Mutschlechner, M., Praeg, N., Illmer, P. The ecological importance of grazing to methane fluxes and engaged microbial communities in alpine forest soils. FEMS Microbiology Ecology. , (2018).
  6. Prem, E. M., Reitschuler, C., Illmer, P. Livestock grazing on alpine soils causes changes in abiotic and biotic soil properties and thus in abundance and activity of microorganisms engaged in the methane cycle. European Journal of Soil Biology. 62, 22-29 (2014).
  7. Praeg, N., Wagner, A. O., Illmer, P. Effects of fertilisation, temperature and water content on microbial properties and methane production and methane oxidation in subalpine soils. European Journal of Soil Biology. 65, 96-106 (2014).
  8. Wagner, A. O., Prem, E. M., Markt, R., Kaufmann, R., Illmer, P. Formation of phenylacetic acid and phenylpropionic acid under different overload conditions during mesophilic and thermophilic anaerobic digestion. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 359 (2019).
  9. Lins, P., Malin, C., Wagner, A. O., Illmer, P. Reduction of accumulated volatile fatty acids by an acetate-degrading enrichment culture. FEMS Microbiology Ecology. 71 (3), 469-478 (2010).
  10. Wagner, A. O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. Effects of different nitrogen sources on the biogas production – a lab-scale investigation. Microbiological research. 167 (10), 630-636 (2012).
  11. Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
  12. Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds. Biomaterials. 129, 163-175 (2017).
  13. Costilow, R. N., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., et al. Physicochemical Factors in Growth. Methods for General and Molecular Microbiology. , 309-329 (2007).
  14. Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review. European Journal of Soil Biology. 37 (1), 25-50 (2001).
  15. . Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material. VDI Richtlinien. , (2006).
  16. Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).

Tags

AnaerobicAnoxicOxygen-freeREDOX IndicatorReducing AgentAnaerobic DigesterSludgeSerum FlaskInoculumLiquid CultureMedium PreparationMicroorganism Cultivation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image