إعداد متوسط لزراعة الكائنات الحية الدقيقة في ظل ظروف اللاهوائية / اللاهوائية بدقة
Summary
وبما أن الكائنات اللاهوائية الملتزمة غير قادرة على النمو عند التعرض للأكسجين، فإن استخدام تقنيات الزراعة اللاهوائية أمر لا غنى عنه. هنا، نبرهن على طريقة بسيطة وفعالة لزراعة ثقافة مختلطة مستمدة من مصنع للغاز الحيوي من إعداد وسائل الإعلام إلى الغاز والقياس الكمي للحمض الدهني المتطاير.
Abstract
على النقيض من الكائنات الهوائية، تتطلب الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية بدقة عدم وجود الأكسجين وعادة ما تكون إمكانية الأكسدة منخفضة لبدء النمو. كما الأكسجين هو في كل مكان في الهواء، والاحتفاظ O2خالية من الظروف خلال جميع خطوات الزراعة هو التحدي ولكن شرطا مسبقا للزراعة اللاهوائية. ويبين البروتوكول المعروض هنا نجاح زراعة ثقافة مختلطة لاهوائية مستمدة من مصنع للغاز الحيوي باستخدام طريقة بسيطة وغير مكلفة. يتم إعطاء وصف دقيق لكامل عملية زراعة اللاكسي بما في ذلك إعداد وسائل الإعلام، وملء قوارير الزراعة، والمكملات الغذائية مع مؤشر الأكسدة والحد من العوامل لتوفير إمكانات الأكسدة منخفضة، فضلا عن تبادل مساحة الرأس للحفاظ على وسائل الإعلام خالية من الأكسجين. وعلاوة على ذلك، يتم توفير نظرة عامة مفصلة على قوارير المصل ضيق الغاز المطهر ة عنطريق التعقيم (باستخدام المحاقن والإبر المعقمة) وظروف الحضانة المناسبة. ويتناول هذا البروتوكول كذلك أخذ عينات من الغاز والسوائل لإجراء تحليلات لاحقة فيما يتعلق بتكوين الغاز وتركيزات الأحماض الدهنية المتطايرة باستخدام الكروماتوغرافيا الغازية والكروماتوغرافيا السائلة العالية الأداء، على التوالي، وعلى حساب الغاز الحيوي والميثان الغلة النظر في قانون الغاز المثالي.
Introduction
على الأرض الأكسجين الجزيئي في تركيزات ملحوظة متاح في المناطق التي لديها اتصال مباشر مع الغلاف الجوي أو في وجود phototrophs الأكسجين. وتسمى البيئات التي يكون فيها الأكسجين غائبا اللاهوائية. ومع ذلك، تحويل الطاقة لا يزال ممكنا في ظل الظروف اللاهوائية عن طريق اثنين من العمليات الأيضية المختلفة، والتخمير والتنفس اللاهوائي1.
في حين أن الكائنات التي تمر بالتنفس الهوائي تستخدم الأكسجين كمقبل الإلكترون الطرفي، فإن التنفس اللاهوائي يتطلب مقبلين إلكترون بديلين مثل النترات أو الكبريتات2. في ما يسمى “برج الإلكترون”، يتم تنظيم الأزواج الأكسدة وفقا لإمكاناتها الأكسدة، مع تلك الأكثر سلبية تقع في الجزء العلوي (المانحين الإلكترون) وأقوى عوامل الأكسدة مع إمكانية الأكسدة الإيجابية في الجزء السفلي (تقبل الإلكترون). نقل الإلكترون بين المانحين والمقبولين يؤدي إلى الحفاظ على الطاقة عن طريق ما يسمى سلسلة الجهاز التنفسي والإلكترونات يمكن التقاطها من قبل تقبل الإلكترون – للبقاء في الصورة – في طوابق مختلفة من البرج. وبالتالي، كلما ارتفع سقوط الإلكترونات من خلال برج الإلكترون، كلما زاد استهلاك الطاقة من خلال رد الفعل المعني. لذلك، التنفس ممكن أيضا في الموائل اللاهوائية، على سبيل المثال، مع أزواج الأكسدة بما في ذلك NO3–/ NO2–، حمض الفوماريك / حمض السوتشينيك، SO32-/ H2S، S° / H2S، Mn (IV)/Mn (II) )، Fe(III)/Fe(II)2،3. أولا، يتم حفظ الطاقة الناتجة كإمكانات الغشاء، والتي تستخدم في وقت لاحق عن طريق الفسفور نقل الإلكترون لتوليف أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) بواسطة غشاء ملزمة ATP-synthases. وعلى النقيض من التنفس الهوائي، يمكن تخفيض كمية الطاقة التي يمكن الحفاظ عليها عن طريق التنفس اللاهوائي بشكل كبير. ومع ذلك، فإن إنتاج الطاقة من معظم التنفس اللاهوائي لا يزال أعلى بالمقارنة مع التخمير، ومسار الحفاظ على الطاقة اللاهوائية في الموائل التي تفتقر إلى الأكسجين وغيرها من تقبل الإلكترون الطرفية2.
أثناء التخمير، يتم تحلل ركائز العضوية الغنية بالطاقة إلى مختلف منتجات التخمير التي غالباً ما تحدد اسم العملية الشاملة، على سبيل المثال، التخمير الكحولي. وعلى النقيض من عمليات التنفس، يقتصر توليد ATP أثناء التخمير على الفسفورية على مستوى الركيزة التي يتم خلالها نقل مجموعة الفوسفات إلى أدينوسين-دي فوسفات (ADP) من الركيزة الفسفورية الغنية بالطاقة2. الكائنات الحية الدقيقة التخمير تلعب دورا مركزيا في تدهور اللاهوائية من المواد العضوية لأنها اللاعبين الرئيسيين في انهيار الركيزة. منتجات التخمير الأولية، مثل الأحماضالعضوية، والكحول، CO 2، و H2،ويمكن استخدامها في وقت لاحق من قبل الكائنات الحية الدقيقة التخمير الثانوية لإنتاج حمض الخليك، CO2،و H2. وتشمل الأمثلة على منتجات التخمير حمض اللبنيك، ومختلف الأحماض الدهنية المتطايرة (الفورميك، الخليك، بروبيونيك، بوتيريك، حمض حشيشة الهر)، ن-بيوتانول، 2،3-بيوتانديول، الأسيتون، والإيثانول.
زراعة الكائنات الحية الدقيقة في ظل ظروف لاهوائية بحتة يتطلب أساليب ومعدات مختلفة تماما مقارنة مع زراعة الكائنات الهوائية. في حين أن الكائنات التي تحمل الأكسجين غالبا ما تزرع على أطباق أجار، ما يسمى الثقافات السطحية، وهذا هو – مع استثناءات قليلة – بالكاد ممكن للكائنات الدقيقة اللاهوائية بدقة. لذلك، يتم تأسيس ثقافات الإثراء من الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية بدقة أساسا في وسائل الإعلامالسائلة تطبيق الأوعية الثقافية مختومة مع الحاجز ضيق الغاز التي تضمن الغلاف الجوي خالية من الأكسجين headspace 4،6، 7.
وسيوفر الوصف الحالي للبروتوكول أساليب زراعة مناسبة للكائنات الدقيقة المستهدفة من مجموعة مختلطة من السكان المستمدة من مصنع للغاز الحيوي اللاهوائي. بل إن عزل الثقافات النقية وزراعتها أكثر تحديا ولكنليس جزءا من هذا العمل.
هنا، نعرض الإجراء لزراعة مجتمع الميكروبات اللاهوائية على أساس دراسة تتعلق بتكوين أحماض فينيل أثناء الهضم اللاهوائي للركائز البروتينية8. تألف المجتمع الميكروبي من أعضاء من جميع المراحل الأربع للهضم اللاهوائي: التحلل المائي، والتكوين الحمضي، وتكوين الأسيتوجيني، وتكوين الميثانوجينيس. تم تطبيق وسيلة الملح المعدني ة مع مصدر الكربون، مؤشر الأكسدة، وفيتامين ومحلول عنصر النزر، والحد من عامل9. تم تعديل المتوسط مع الركائز السلائف حمض فينيل البروتينية ذات الصلة8.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الأكثر أهمية وحاسمة في زراعة الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية هو ضمان ظروف خالية من الأكسجين في وسائل الإعلام زراعة وقوارير ‘مساحة الرأس. يمكن استخدام مؤشر مثل ريسازورين للتحقق بشكل غير مباشر من ملء اللاهوائية الصحيحة من قوارير. ريسازورين هو صبغة الأكسدة شائعة الاستخدام لأنها غير مكلفة وغير سامة، وفعالة بالفعل في جرعات منخفضة وقصيرة الحضانة مرات 12. عندما أدرجت في وسائل الإعلام، ريسازورين الملونة الزرقاء يخضع أولا خطوة تخفيض لا رجعة فيها إلى resorufin، وهو وردي في قيم درجة الحموضة محايدة. يمكن أن يحدث هذا التفاعل الأول عندما يتم تسخين وسائل الإعلام 13. في وقت لاحق، يتم تقليل resorufin إلى ثنائي اللون dihydroresorufin في رد فعل ثانوي عكسها (الشكل7)12. نظام ريسوروفين /ديهيدروريسوروفين ريدوكس يصبح عديم اللون تماما في إمكانية الحد من الأكسدة القياسية من حواليH = -110 mV ويتحول الوردي فوق إمكانات الأكسدة من -51 mV 13.
من أجل زيادة الحد من إمكانات الأكسدة، على سبيل المثال، لتسهيل نمو الكائنات الحية الدقيقة المثاني من المعروف أنها تتطلب أقل من -200 ملفي14،يمكن إضافة حل Na2S. بدلا من ذلك، السيستين-حمض الهيدروكلوريك، الصوديوم-ثيوغليكولات، أو ثنائي ثيونيت الصوديوم تستخدم عادة. ومع ذلك، فإن أي عامل تقليل مناسب للاستخدام يعتمد على الإعداد التجريبي المعني وقد يتطلب اهتماماً خاصاً. على سبيل المثال، ثيوغليكولات الصوديوم يحتاج إلى تنشيط درجة الحرارة (على سبيل المثال، عن طريق الأوتوكلاف).
ويمكن زيادة تقييم اتحاد الميكروبات المتوازن، الذي يتألف من أجناس مختلفة من البكتيريا وArchaea، وسلسلة تدهور لاهوائي تعمل بكفاءة من خلال تحديد تكوين غاز الفضاء الرئيسي في قوارير الثقافة عن طريق الغاز اللوني. عند التعامل مع مركبات مثل أحماض فينيل مشتقة من سلائف مختلفة، وتقييم مساحة الرأس هو وسيلة سريعة للتحقق من عملية تكوين الميثانوجينيس8. يشير تركيز مساحة الرأس CH4 بنسبة 50-60% تقريبًا في الضوابط في نهاية فترة الحضانة إلى الاستخدام الناجح للمغذيات التطبيقية وبالتالي تمعدن المواد العضوية في الظروف اللاهوائية. يمكن تحديد إنتاج الميثان النظري وتركيزات الميثان المتوقعة أثناء عملية الهضم مسبقاً وفقاً لمعادلة بوسويل بويل بعد التحليل الأولي للغواصة أو عن طريق تقدير محتوى الكربوهيدرات والبروتينات والدهون في الركيزة. وفقا لVDI 4630 15،يمكن أن تؤدي الكربوهيدرات إلى إنتاج الغاز الحيوي النظري من 750 ل كجم-1 VSS (50٪ CH4 و 50٪ CO2)،والبروتينات إلى 800 لتر كجم-1 VSS (72٪ CH4 و 28٪ CO2)،والدهون إلى 1390 لكجم -1 VSS (60٪ CH4 و 40٪ CO2).
وعلاوة على ذلك، تم رصد التكوين والتدهور المحتمل اللاحق لـ VFAs والأحماض فينيل. ويمكن تقييم عملية التحلل عن طريق تحليل تركيزات VFA (على سبيل المثال، خلات، بروبيونات) في نقاط زمنية مختلفة. تراكم الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة مثل خلات و / أو بروبيونات يمكن أن تشير إلى اضطرابات في تكوين المجتمع methanogenic وإلى الحمل الزائد مفاعل عموما. ومع ذلك، يمكن لشلال التدهور الميكروبي متوازن حتى التعامل مع تركيزات VFA عالية جدا وخلات9. الى جانب ذلك، فإن خلات / نسبة بروبيونات قد توفر المزيد من المعلومات عن حالة المفاعل العام16. ومع ذلك، هناك العديد من المعلمات المناسبة لرصد العمليات التي يتعين اختيارها وفقا للفرضيات التجريبية المقترحة. وفي المثال الحالي، كانت المتغيرات المستهدفةهي تركيزات حمض فينيل (الشكل 6).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل صندوق العلوم النمساوي (FWF): أرقام المشروع P 29360 و P 29143. وحظيت النشرة بدعم من بوبليكationsfonds der Universität Innsbruck. ونحن نعترف إلى حد كبير EIG.
Materials
| culture flasks (120 mL, N20) | Ochs, Germany | 102046 | |
| buty rubber septa (N20) | Ochs, Germany | 102049 | |
| aluminium caps (N20) | Ochs, Germany | 102050 | |
| N2 gas | Messer, Austria | purity 5.0 | |
| syringes + cannulae | various | ||
| crimper | Ochs, Germany | 102051 | |
| de-crimper | Ochs, Germany | 102052 | |
| GC2010 | Shimadzu | ||
| Shin-carbon GC column | Restek | chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2 | |
| HPLC Prominence | Shimadzu | ||
| Fast Fruit HPLC Column | Phenomenex | chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc. |
References
- Wiebe, W. J., Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G., et al. Anaerobic Respiration and Fermentation. The Ecology of a Salt Marsh. , 137-159 (1981).
- Kim, B. H., Gadd, G. M., Kim, B. H., Gadd, G. M. Anaerobic fermentation. Bacterial physiology and metabolism. , 252-297 (2008).
- Stolz, J. F., Oremland, R. S. Bacterial respiration of arsenic and selenium). FEMS Microbiology Reviews. 23 (5), 615-627 (1999).
- Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic Methanogenesis and Autotrophic Growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
- Mutschlechner, M., Praeg, N., Illmer, P. The ecological importance of grazing to methane fluxes and engaged microbial communities in alpine forest soils. FEMS Microbiology Ecology. , (2018).
- Prem, E. M., Reitschuler, C., Illmer, P. Livestock grazing on alpine soils causes changes in abiotic and biotic soil properties and thus in abundance and activity of microorganisms engaged in the methane cycle. European Journal of Soil Biology. 62, 22-29 (2014).
- Praeg, N., Wagner, A. O., Illmer, P. Effects of fertilisation, temperature and water content on microbial properties and methane production and methane oxidation in subalpine soils. European Journal of Soil Biology. 65, 96-106 (2014).
- Wagner, A. O., Prem, E. M., Markt, R., Kaufmann, R., Illmer, P. Formation of phenylacetic acid and phenylpropionic acid under different overload conditions during mesophilic and thermophilic anaerobic digestion. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 359 (2019).
- Lins, P., Malin, C., Wagner, A. O., Illmer, P. Reduction of accumulated volatile fatty acids by an acetate-degrading enrichment culture. FEMS Microbiology Ecology. 71 (3), 469-478 (2010).
- Wagner, A. O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. Effects of different nitrogen sources on the biogas production – a lab-scale investigation. Microbiological research. 167 (10), 630-636 (2012).
- Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
- Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds. Biomaterials. 129, 163-175 (2017).
- Costilow, R. N., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., et al. Physicochemical Factors in Growth. Methods for General and Molecular Microbiology. , 309-329 (2007).
- Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review. European Journal of Soil Biology. 37 (1), 25-50 (2001).
- . Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material. VDI Richtlinien. , (2006).
- Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
