Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten
Summary
Moedermelk zendt humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hoewel slechts ~ 15% van zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd raken. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel deze cellen zijn onderonderzocht. Hier beschrijven we de isolatie van moedermelk leukocyten en een analyse van hun fagocytische capaciteit.
Abstract
Zelfs bij afwezigheid van antiretrovirale geneesmiddelen, wordt slechts ~ 15% van de zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd, wat duidt op een sterk beschermend effect van moedermelk (BM). Tenzij de toegang tot schoon water en de juiste zuigelingenvoeding betrouwbaar is, raadt de WHO het staken van de borstvoeding voor HIV-geïnfecteerde moeders niet aan. Talrijke factoren waarschijnlijk werken in tandem om BM transmissie te verminderen. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel wat grotendeels onduidelijk blijft is de bijdrage van deze cellen aan de ANTIVIRALE kwaliteiten van BM. op dit moment waren we gericht op het isoleren van cellen van menselijke BM om te meten antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP), een van de meest essentiële en pervasieve aangeboren immuunresponsen, door BM fagocyten tegen HIV-doelwitten. Cellen werden geïsoleerd uit 5 menselijke BM monsters verkregen in verschillende stadia van de lactatie. Isolatie werd uitgevoerd via zachte centrifugeren gevolgd door zorgvuldige verwijdering van melkvet en herhaald wassen van de celpellet. Fluorescerende parels bedekt met HIV-envelop (env) epitoop werden gebruikt als doelstellingen voor analyse van ADCP. Cellen werden bevlekt met de CD45 oppervlakte marker om leukocyten te identificeren. Er werd vastgesteld dat ADCP-activiteit significant was boven controle-experimenten en reproduceerbare meetbaar met behulp van een HIV-specifiek antilichaam 830A.
Introduction
Menselijke moedermelk (BM) bestaat uit moeder cellen die > 90% levensvatbaar1. Cel samenstelling wordt sterk beïnvloed door het stadium van de lactatie, gezondheidstoestand van moeder en zuigeling, en individuele variatie, die blijft slecht begrepen1,2,3,4. Gezien het feit dat BM ~ 103− 105 leukocyten/ml bevat, kan worden geschat dat zuigelingen met borstvoeding ongeveer 105− 108 moeder leukocyten per dag innemen5. Verschillende in vivo studies hebben aangetoond dat maternale leukocyten kritische immuniteit bieden aan de zuigeling en functioneel ver buiten deze sites van initiële inname5,6,7,8 ,9,10,11. Alle maternally-afgeleide cellen ingenomen door de zuigeling hebben het potentieel om immune functies uit te voeren naast of te compenseren voor de zuigeling eigen leukocyten12.
De overdracht van moeder naar kind (MTCT) van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) blijft een crisis in landen met beperkte middelen. Aangezien diarree en luchtwegaandoeningen verantwoordelijk zijn voor een aanzienlijk sterftecijfer bij zuigelingen in hulpbronnen beperkte landen, en deze ziekten aanzienlijk worden verminderd door exclusieve borstvoeding, zijn de voordelen voor HIV-geïnfecteerde moeders van borstvoeding veel zwaarder dan de Risico’s13,14,15. Tenzij de toegang tot schoon water en de juiste zuigelingenvoeding betrouwbaar is, raadt de WHO het staken van de borstvoeding voor HIV-geïnfecteerde moeders16niet aan. Ongeveer 100.000 MTCTs via BM komen jaarlijks voor; Toch wordt slechts ~ 15% van de zuigelingen die borstvoeding krijgen door hun HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd, wat een sterk beschermend effect van BM17,18,19,20,21suggereert. Talrijke factoren werken waarschijnlijk in tandem om transmissie te voorkomen. Belangrijk is dat HIV-specifieke antilichamen (ABS) in BM zijn gecorreleerd met verminderde MTCT en/of een verminderde baby sterfte van HIV-infectie22,23. Wat grotendeels onduidelijk blijft, is de bijdrage van de cellulaire fractie van BM aan zijn antivirale kwaliteiten.
Veel ABS vergemakkelijkt een verscheidenheid aan antivirale activiteiten die worden gemedieerd door de ‘ constante ‘ regio van het immunoglobuline molecuul, het kristalverbare fragment (FC), via interactie met FC receptoren (FcRs) gevonden op vrijwel alle aangeboren immuuncellen, vrijwel allemaal zijn te vinden in Human BM24. Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) is aangetoond indien nodig voor de klaring van virale infecties en is onderonderzocht in het geval van preventie van MTCT van HIV25,26,27, 28 , 29. gezien de schaarste van kennis over de potentiële bijdrage van de ADCP-activiteit door BM fagocyten aan de preventie van MTCT van HIV, hebben we ons gericht op het ontwikkelen van een rigoureuze methode om cellen te isoleren van menselijke BM om een studie te verrichten van ADCP gemedieerd door cellen uit BM verkregen in verschillende stadia van de lactatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De flow cytometrie-gebaseerde techniek voor het meten van de ADCP-activiteit beschreven in dit document werd voor het eerst beschreven in 201130 en is sindsdien robuust en aangehaald in meer dan 80 studies. Het hier beschreven protocol past deze techniek voor de eerste keer aan voor gebruik met primaire BM-cellen. Eerdere studies met FC-gemedieerde functionaliteit van BM Cells zijn grotendeels beperkt tot het meten van oxidatieve uitbarstingen of op histologie gebaseerde fagocytose assays met cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. Susan Zolla-Pazner in het departement geneeskunde en departement microbiologie aan de Icahn school of Medicine op de berg Sinai voor manuscript Review. Het NIH/NICHD verstrekte financiering voor dit project onder grantnummer R21 HD095772-01A1. Daarnaast werd R. Powell gesteund door fondsen van de afdeling geneeskunde, afdeling besmettelijke ziekten, Icahn school of Medicine op de berg Sinaï.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer’s Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. . Antibody Fc. , (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
