Изоляция конкретных популяций нейронов от roundworm Caenorhabditis elegans
Summary
Здесь мы представляем протокол для простой изоляции конкретных групп живых нейрональных клеток, выражающих зеленый флуоресцентный белок из трансгенных линий Caenorhabditis elegans. Этот метод позволяет различные исследования ex vivo сосредоточены на конкретных нейронов и имеет возможность изолировать клетки для дальнейшего краткосрочного культивирования.
Abstract
В процессе старения многие клетки накапливают высокий уровень повреждений, приводящих к клеточной дисфункции, которая лежит в основе многих гериатрических и патологических состояний. Постмиотические нейроны представляют собой основной тип клеток, пострадавших от старения. Хотя существует несколько моделей старения нейронов млекопитающих, их установить сложно и дорого. Круглый червь Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения старения нейронов, так как эти животные имеют короткую продолжительность жизни, доступнынадежный генетический инструментарий, и хорошо каталогизированной нервной системы. Представленный в данном случае метод позволяет беспрепятственно осваить конкретные клетки на основе экспрессии трансгенного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Трансгенные линии животных, выражающие GFP под различными, клеточными типами,специфическими промоутерами, усваиваются для удаления внешней кутикулы и мягко нарушаются для производства шлама, содержащего различные типы клеток. Клетки интереса после этого отделены от non-target клеток через флуоресцентно-активированную сортировку клетки, или anti-GFP-соединенными магнитными шариками. Изолированные клетки могут быть культивированы в течение ограниченного времени или немедленно использованы для клеточного анализа ex vivo, таких как транскрипционный анализ количественного ПЦР в реальном времени. Таким образом, этот протокол позволяет быстро и надежный анализ клеточных реакций в различных нейронных популяций в C. elegans.
Introduction
За последние несколько десятилетий, метазоановый модель организма Caenorhabditis elegans был огромный актив в изучении нейронов, нейронных схем и его роль в физиологических и поведенческих реакций, и старение связанных нейродегенеративных Заболеваний. Уникальной особенностью C. elegans является то, что животные прозрачны, что позволяет для линии всех взрослых соматических клеток, которые будут отображены1. C. elegans также гавани управляемое количество нейронов, что приводит к морфологии и подключения нервной системы хорошо понимается2. Инвариантная клеточная линия, короткая продолжительность жизни и обилие высокопроизводительных генетических инструментов, доступных для C. elegans, делают его идеальным модельным организмом для изучения старения в различных нейронных популяциях.
Старение нейронов и нейродегенеративных расстройств являются сложными, и каждое расстройство имеет уникальные патологические подписи, связанные с ним. Однако, для многих из этих расстройств, таких как болезнь Паркинсона и болезни Альцгеймера, общей чертой является прогрессирующая нагрузка неправильно сложенных белков3,4,5. В обоих этих заболеваний, белки неправильно и совокупности в клетке, чтобы вызвать токсичность, в конечном счете, приводит к гибели клеток4,5. Для правильного старения нейронов важен гомеостаз митохондрий, в частности белковый гомеостаз, так каквозмущения и дисхомеостаз могут привести к нейродегенерации 6,7,8. Клетки оснащены различными механизмами для поддержания белка гомеостаза, один из которых разворачивается ответ белка (UPR) – классический путь, где сигналы от эндоплазмического ретикулума (ER) активировать внутриклеточного сигнала каскадов, что приводит к транскрипции ответ9. Сродни этому UPRER, метазоаны отображают аналогичный ответ на потерю митохондриального белка гомеостаза, так называемого митохондриального УПО (UPRmt)7,8. C. elegans, как представляется, наиболее базальный организм, чтобы иметь подтвержденный и четко определенный путь UPRMT 7.
Функция /дисфункция конкретных нейронных популяций в рамках более широкой сети может быть трудно оценить из-за их внутренней связи и сложности3. Тем не менее, часто необходимо изучить различные нейронные популяции из-за клеточных типконкретных заболеваний со сложными патологиями, таких как те, которые связаны с нарушениями клеточного белка гомеостаза. В C. elegans, конкретные нейронные популяции могут быть генетически манипулировать позволяет легкого наблюдения in vivo. Нервная система C. elegans в основном состоит из нейронов, с небольшим процентом глиальных клеток. У взрослых червей гермафродита, Есть около 302 нейронов, подразделяются на более чем 100 различных классов2,10. Нейроны, такие как холинергические нейроны преобладают в нервно-мышечных узлов, в то время как дофаминергические нейроны в первую очередь участвуют в сенсации10,11. Как двигательная активность и сенсорные способности снижаются с возрастом, важно подробно механистические идеи о дефектах в этих отдельных нейронов11,12. Таким образом, существует необходимость в простой и надежный метод для изоляции нетронутых клеток, представляющих интерес для последующих исследований ex vivo.
Здесь мы описываем оптимизированный эффективный метод быстрой изоляции специфических нейрональных клеток, выражающих зеленый флуоресцентный белок (ГФП) от C. elegans. Этот метод изоляции может быть выполнен на личинки, несовершеннолетних или взрослых червей. Изоляция клеток от личинок червей была ранее опубликована Чжан и др.13 и не будет обсуждаться здесь. Важно отметить, что все черви должны быть на одной стадии жизни, чтобы предотвратить переваривание животных или загрязнения от животных в различных стадиях жизни. Через ферментативные и механические нарушения кутикулы нематод, экзоскелет с высоким содержанием коллагена и других структурных белков, широкий спектр клеток могут быть изолированы13,14. Клетки могут быть изолированы через цитометрию потока или антитела помечены магнитные бусы. Как правило, РНК изолирована с помощью фенола и гуанидина изотиоцианата метод для обеспечения обогащения желаемой популяции клеток15. С большой осторожностью эти изолированные клетки могут быть сохранены в культуре колбу или несколько хорошо блюдо. Этот метод представляет собой уникальный и мощный инструмент в изучении конкретных нейронов и имеет возможность изолировать живые и функциональные клетки для дальнейшего культивирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Круглый червь C. elegans является устоявшейся и мощной моделью для изучения нейронального здоровья и болезни2. С достаточным и генетическим инструментом для манипулирования этими животными и управляемым количеством точно отображенных различных типов нейронов, большое к…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Дженнифер Фокс и членов лаборатории Халимончука за глубокие комментарии. Мы признаем поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (R01 GM108975 в ОК и T32 GM107001-01A1 до E.M.G.).
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
- Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
- Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
- Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
- Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
- Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
- Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
- Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
- Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).
