בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד פשוט של קבוצות מסוימות של תאים עצביים חיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק מקווי האלגניים של הקווים. שיטה זו מאפשרת מגוון של מחקרים vivo ex התמקדו נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים עבור לטווח קצר יותר culturing.
Abstract
במהלך תהליך ההזדקנות, תאים רבים מצטברים רמות גבוהות של נזק המוביל לתפקוד לקוי של הסלולר, אשר ביסוד הרבה מצבים גריאטרי ופתולוגי. הנוירונים פוסט-mitotic מייצגים סוג תא ראשי המושפע על ידי הזדקנות. למרות שדגמים מרובים של הזדקנות עצבית קיימים, הם מאתגרים ויקרים להקמת. האלגיה העגולה של התולעים העגולות היא מודל רב-עוצמה לחקר הזדקנות עצבית, מאחר שלחיות אלה יש תוחלת חיים קצרה, כתיבת כלים גנטית חזקה ומערכת עצבים מקוטלקת היטב. השיטה המוצגת בזאת מאפשרת בידוד חלק של תאים ספציפיים בהתבסס על הביטוי של חלבון פלורסנט ירוק טרנסגניים (GFP). קווי בעלי חיים טרנסגניים המבטא GFP תחת נבדל, סוג תא ספציפי היזמים מתעכלים כדי להסיר את הקוטיקולה החיצונית בעדינות שיבש מכני כדי לייצר שובלים המכילים סוגי תאים שונים. תאי העניין מופרדים לאחר מכן מתאים שאינם יעד באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות פלואורסצנטית, או באמצעות חרוזים מגנטיים אנטי-GFP בשילוב. התאים המבודדים לאחר מכן יכול להיות מתורבת לזמן מוגבל או באופן מיידי משמש לניתוח ספציפי לתא לשעבר vivo כגון ניתוח ההמרה על ידי PCR בזמן אמת כמותי. לפיכך, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מהיר ויציב של תגובות לתאים ספציפיים בתוך אוכלוסיות נוירואליות שונות בג.
Introduction
במהלך העשורים האחרונים, האורגניזם המודל החדש Caenorהאבודיטיס מודל היה נכס עצום בחקר הנוירונים, המעגלים העצביים ותפקידה בתגובות פיסיולוגיים והתנהגותיים, והזדקנות הקשורים נוירוניווניות חלות. התכונה הייחודית של הג היא שבעלי החיים שקופים, ומאפשרים שושלת היוחסין של כל התאים הסומאטיים הבוגרים להיות ממופים1. ג. אלגיה מקיימת גם כמות של נוירונים, המובילה לתחום המבנה והקישוריות של מערכת העצבים שהבינה היטב2. השושלת הקבועה של התאים, תוחלת החיים הקצרה והשפע של כלים גנטיים בתפוקה גבוהה הזמינות עבור C. אלגיה הופכים אותו לאורגניזם מודל אידיאלי לחקר ההזדקנות בתוך אוכלוסיות נוירואליות שונות.
הזדקנות הנוירונים והפרעות ניווניות הן מורכבות, וכל הפרעה יש חתימות פתולוגיים ייחודי הקשורים בו. עם זאת, עבור רבים מהפרעות אלה, כגון מחלת פרקינסון ואלצהיימר, תכונה נפוצה היא העומס הפרוגרסיבי של חלבונים misfolded3,4,5. בשתי מחלות אלה, חלבונים misfold לצבור בתוך התא כדי לגרום לרעילות, בסופו של דבר המוביל למוות התאים4,5. עבור הזדקנות נאותה של נוירונים, הומאוסטזיס של המיטומטר, יותר במיוחד הומאוסטזיס חלבון, חשוב, כמו רטבאליות ו dyshomeoאוסטזיס יכול להוביל נוירוניוון6,7,8. תאים מצוידים מנגנונים שונים כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון, אחד להיות תגובת חלבון שפרש (upr) – מסלול קלאסי שבו אותות מן הרשתית רשתית פלזמית (ER) להפעיל אות תאיים מפלי, המוביל להמרה . תשובה9 לאורזה, מטזואים להציג תגובה דומה אובדן של הומאוסטזיס חלבון מיטוכונדריאלי, המכונה כביכול upr (uprmt)7,8. ג. אלגיה נראה האורגניזם הבזלי ביותר להיות מאומת ומוגדר היטב מסלולהר 7.
פונקציה/תפקוד של אוכלוסיות נוירואליות ספציפיות בתוך רשת גדולה יותר יכול להיות קשה להעריך בשל הקישוריות הפנימית שלהם ואת המורכבות3. עם זאת, יש לעיתים קרובות צורך ללמוד אוכלוסיות עצביים נפרדות בשל סוג תא מחלות ספציפיות עם פתווגיות מורכבות, כמו אלה הקשורים עם לקויי חלבון הומאוסטזיס הסלולר. בתוך C. אלאנים, אוכלוסיות נוירואליות מסוימות יכולות להיות מניפולציות גנטית המאפשרות התבוננות נתיישב בvivo. מערכת העצבים של C. אלגיה מורכבת בעיקר מנוירונים, עם אחוז קטן של תאים גליאל. ב תולעים דו-מיניים למבוגרים, ישנם כ 302 נוירונים, מחולק למעל 100 כיתות שונות2,10. נוירונים כגון cholinergic נוירונים להשתלט על הצמתים נוירוסקולריות, בעוד נוירונים דואמנרגיים מעורבים בעיקר תחושה10,11. כאשר הן פעילות מוטורית והן יכולות חישה לירידה עם הגיל, חשוב לפרט תובנות מכניסטיות על פגמים בנוירונים בודדים אלה11,12. ככזה, יש צורך בשיטה פשוטה ואיתנה כדי לבודד תאים שלמים של עניין למחקרים הבאים vivo ex.
כאן, אנו מתארים שיטה יעילה ממוטבת לבידוד מהיר של תאים עצביים ספציפיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מ -C. אלגיה. ניתן לבצע שיטת בידוד זו על תולעים, לקטינים או למבוגרים. בידוד של תאים מתולעי זחל פורסם בעבר על ידי ג’אנג ואח ‘13 ולא יידונו כאן. הערה חשובה כאן היא שכל התולעים צריכות להיות באותו שלב של החיים כדי למנוע העיכול של בעל החיים או זיהום מבעלי חיים בשלבי חיים שונים. באמצעות שיבושים אנזימטי ומכני של הקוטיקולה נמטודות, הגבוהה שלד חיצוני קולגן וחלבונים מבניים אחרים, מגוון רחב של תאים יכול להיות מבודד13,14. תאים לאחר מכן יכול להיות מבודד באמצעות cy, הזרמת לנסות או נוגדנים המסומנים חרוזים מגנטיים. בדרך כלל, רנ א מבודד באמצעות פנול ו guanidine isothiyanate שיטה כדי להבטיח את העשרת האוכלוסיה הרצויה של התאים15. עם טיפול הרבה תאים אלה מבודדים ניתן לשמור בבקבוקון תרבות או מרובת היטב צלחת. שיטה זו מייצגת כלי ייחודי ורב עוצמה במחקר של נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים חיים פונקציונלי עבור culturing נוספת.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודל התולעים העגולות הוא דגם מבוסס ועוצמתי לחקר בריאות ומחלות עצביים2. עם כלים גנטיים בשפע כדי לתמרן בעלי חיים אלה וכמות לניהול של סוגים שונים של נוירונים ממופה בדיוק, מידע רב ניתן לאסוף עם כמות קטנה יחסית של חומר. כאן, אנו מתווה שיטה ממוטבת כדי לבודד נוירונים שונים מחיות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד ר ג’ניפר פוקס ולחברי מעבדת ח’אימונצ’וק להערות תובנה. אנו מכירים את התמיכה של המכון הלאומי לבריאות (R01 GM108975 כדי בסדר ו T32 GM107001-01A1 ל E.M.G.).
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
- Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
- Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
- Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
- Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
- Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
- Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
- Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
- Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).
