Isolierung spezifischer Neuronenpopulationen von Roundworm Caenorhabditis elegans

In den letzten Jahrzehnten war der metazoische Modellorganismus Caenorhabditis elegans ein enormer Vorteil bei der Untersuchung von Neuronen, neuronalen Schaltkreisen und seiner Rolle bei physiologischen und Verhaltensreaktionen sowie alterungsassoziierten neurodegenerativen Krankheiten. Ein einzigartiges Merkmal von C. elegans ist, dass die Tiere transparent sind, so dass die Abstammung aller erwachsenen somatischen Zellen abgebildet werden kann¹. C. elegans beherbergt auch überschaubare Menge an Neuronen, was dazu führt, dass die Morphologie und Konnektivität des Nervensystems gut verstanden wird². Die invariante Zellabstammung, die kurze Lebensdauer und die Fülle der genetischen Werkzeuge mit hohem Durchsatz, die für C. elegans zur Verfügung stehen, machen es zu einem idealen Modellorganismus für die Untersuchung des Alterns in verschiedenen neuronalen Populationen.

Alterung von Neuronen und neurodegenerative Störungen sind komplex, und jede Störung hat einzigartige pathologische Signaturen damit verbunden. Jedoch, für viele dieser Erkrankungen, wie Parkinson und Alzheimer-Krankheit, ein gemeinsames Merkmal ist die fortschreitende Last von falsch gefalteten Proteinen^3,4,5. Bei beiden Krankheiten verrenken sich Proteine und aggregieren innerhalb der Zelle, um Toxizität zu verursachen, was letztlich zum Zelltod^4,5führt. Für die richtige Alterung der Neuronen ist die Homöostase der Mitochondrien, genauer gesagt Proteinhomöostase, wichtig, da Störungen und Dyshomöostase zu Neurodegeneration^6,7,8führen können. Die Zellen sind mit verschiedenen Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase ausgestattet, wobei einer die entfaltete Proteinantwort (UPR) ist – ein klassischer Signalweg, bei dem Signale von endoplasmatischem Retikulum (ER) intrazelluläre Signalkaskaden aktivieren, was zu einer transkriptionellen Antwort⁹. Ähnlich wie dieser UPR^ERzeigen Metazoen eine ähnliche Reaktion auf den Verlust der mitochondrialen Proteinhomöostase, der sogenannten mitochondrialen UPR (UPR^mt)^7,8. C. elegans scheint der basalste Organismus zu sein, der einen bestätigten und genau definierten UPR mt-Signalweg^{hat 7}.

Die Funktion/Dysfunktion bestimmter neuronaler Populationen innerhalb eines größeren Netzwerks kann aufgrund ihrer intrinsischen Konnektivität und Komplexität schwierig zu beurteilen sein³. Jedoch, Es besteht oft die Notwendigkeit, verschiedene neuronale Populationen aufgrund von Zelltyp-spezifischen Erkrankungen mit komplexen Pathologien zu studieren, wie diejenigen, die mit beeinträchtigten zellulären Protein Homöostase verbunden. In C. eleganskönnen spezifische neuronale Populationen genetisch manipuliert werden, was eine einfache Beobachtung in vivo ermöglicht. Das Nervensystem von C. elegans besteht in erster Linie aus Neuronen, mit einem kleinen Prozentsatz von Gliazellen. Bei erwachsenen Hermaphroditwürmern gibt es etwa 302 Neuronen, unterteiltin über 100 verschiedene Klassen 2,¹⁰. Neuronen wie cholinerge Neuronen überwiegen in neuromuskulären Knoten, während dopaminerge Neuronen sind in erster Linie in Sensation^{beteiligt 10,11}. Da sowohl die motorische Aktivität als auch die sensorischen Fähigkeiten mit dem Alter abnehmen, ist es wichtig, mechanistische Erkenntnisse über Defekte in diesen einzelnen Neuronen^11,12zu beschreiben. Daher ist eine einfache und robuste Methode erforderlich, um intakte Zellen von Interesse für nachfolgende Ex-vivo-Studien zu isolieren.

Hier beschreiben wir eine optimierte effektive Methode zur schnellen Isolierung bestimmter neuronaler Zellen, die grünes fluoreszierendes Protein (GFP) aus C. elegans exdrücken. Diese Isolationsmethode kann bei Larven-, Jung- oder Erwachsenenwürmern durchgeführt werden. Die Isolierung von Zellen aus Larvenwürmern wurde zuvor von Zhang et al.¹³ veröffentlicht und wird hier nicht diskutiert. Ein wichtiger Hinweis hier ist, dass alle Würmer im gleichen Lebensstadium sein müssen, um eine Überverdauung des Tieres oder eine Kontamination durch Tiere in verschiedenen Lebensstadien zu verhindern. Durch enzymatische und mechanische Störung der Nematodenhaut, eines kollagenreichen Exoskeletts und anderer struktureller Proteine kann eine Vielzahl von Zellen isoliert werden^13,14. Zellen können dann über Durchflusszytometrie oder Antikörper mit magnetischen Perlen isoliert werden. Typischerweise wird RNA über eine Phenol- und Guanidin-Isothiocyanat-Methode isoliert, um die Anreicherung der gewünschten Zellpopulation¹⁵zu gewährleisten. Mit viel Sorgfalt können diese isolierten Zellen in einem Kulturkolben oder Multi-Well-Gericht gepflegt werden. Diese Methode stellt ein einzigartiges und leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung bestimmter Neuronen dar und hat die Fähigkeit, lebende und funktionelle Zellen für die weitere Kultivierung zu isolieren.