Isolatie van specifieke neuron populaties van Roundworm Caenorhabditis elegans

In de afgelopen decennia, het metazoan modelorganisme Caenorhabditis elegans is een enorme troef in de studie van neuronen, neuronale circuits en haar rol in fysiologische en gedragsmatige reacties, en veroudering-geassocieerde neurodegeneratieve Ziekten. Een unieke eigenschap van C. elegans is dat de dieren transparant zijn, waardoor de afstamming van alle volwassen somatische cellen in kaart kan worden gebracht¹. C. elegans herbergt ook beheersbare hoeveelheid neuronen, wat leidt tot de morfologie en connectiviteit van het zenuwstelsel wordt goed begrepen². De invariante celafstamming, korte levensduur en overvloed aan genetische hulpmiddelen met hoge doorvoer die beschikbaar zijn voor C. elegans maken het een ideaal modelorganisme voor de studie van veroudering binnen verschillende neuronale populaties.

Veroudering van neuronen en neurodegeneratieve aandoeningen zijn complex, en elke stoornis heeft unieke pathologische handtekeningen die ermee verbonden zijn. Echter, voor veel van deze aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson en Alzheimer, een gemeenschappelijk kenmerk is de progressieve belasting van verkeerd gevouwen eiwitten^3,4,5. In beide van deze ziekten, eiwitten misvouwen en aggregaat binnen de cel om toxiciteit te veroorzaken, uiteindelijk leiden tot celdood^4,5. Voor de juiste veroudering van neuronen, de homeostase van de mitochondriën, meer specifiek eiwit homeostase, is belangrijk, als verstoringen en dyshomeostase kan leiden tot neurodegeneratie^6,7,8. Cellen zijn uitgerust met verschillende mechanismen om eiwit homeostase te handhaven, één is de ongevouwen eiwit respons (UPR) ― een klassieke route waarbij signalen van endoplasmisch reticulum (ER) intracellulaire signaal Cascades activeren, wat leidt tot een transcriptionele Response⁹. Verwant aan deze UPR^er, figuur vertonen een soortgelijke reactie op het verlies van mitochondriale eiwit homeostase, de zogenaamde mitochondriale UPR (UPR^MT)^7,8. C. elegans lijkt het meest basale organisme te zijn dat een bevestigde en goed gedefinieerde UPR^MT traject⁷heeft.

De functie/disfunctie van specifieke neuronale populaties binnen een groter netwerk kan moeilijk te beoordelen zijn vanwege hun intrinsieke connectiviteit en complexiteit³. Echter, er is vaak een behoefte om te bestuderen van verschillende neuronale populaties als gevolg van celtypespecifieke ziekten met complexe pathologieën, zoals die in verband met verminderde cellulaire eiwit homeostase. In C. eleganskunnen specifieke neuronale populaties genetisch gemanipuleerd worden, waardoor faciele observatie in vivo mogelijk is. Het zenuwstelsel van C. elegans bestaat voornamelijk uit neuronen, met een klein percentage gliacellen. Bij volwassen hermafrodiet wormen zijn er ongeveer 302 neuronen, onderverdeeld in meer dan 100 verschillende klassen^2,10. Neuronen zoals cholinerge neuronen overheersingen in neuromusculaire knooppunten, terwijl Dopaminerge neuronen voornamelijk betrokken zijn bij sensatie^10,11. Aangezien zowel motorische activiteit als zintuiglijke vaardigheden afnemen met de leeftijd, is het belangrijk om mechanistische inzichten over defecten in deze individuele neuronen te detail te bekijken^11,12. Als zodanig is er behoefte aan een eenvoudige en robuuste methode om intacte cellen van belang te isoleren voor latere ex vivo-studies.

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde effectieve methode voor de snelle isolatie van specifieke neuronale cellen die groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken uit C. elegans. Deze isolatiemethode kan worden uitgevoerd op larvale, juveniele of volwassen wormen. Isolatie van cellen van larvale Worms werd eerder gepubliceerd door Zhang et al.¹³ en zal hier niet worden besproken. Een belangrijke opmerking hier is dat alle wormen in dezelfde levensfase moeten zijn om overmatige vertering van het dier of besmetting van dieren in verschillende levensstadia te voorkomen. Door zowel enzymatische als mechanische verstoring van de nematode cuticula, een exoskelet hoog in collageen en andere structurele eiwitten, kan een grote verscheidenheid aan cellen worden geïsoleerd^13,14. Cellen kunnen vervolgens worden geïsoleerd via Flowcytometrie of antilichaam gelabelde magnetische kralen. Typisch, RNA is geïsoleerd via een fenol en guanidine isothiocyanaat methode om te zorgen voor de verrijking van de gewenste celpopulatie¹⁵. Met veel zorg kunnen deze geïsoleerde cellen worden gehandhaafd in een kweek kolf of multi-well gerecht. Deze methode vertegenwoordigt een unieke en krachtige tool in de studie van specifieke neuronen en heeft de capaciteit om te isoleren van levende en functionele cellen voor verdere culturing.