عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لعزل بسيط لمجموعات محددة من الخلايا العصبية الحية التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر من خطوط Caenorhabditis elegans المعدلة وراثيا. هذه الطريقة تمكن مجموعة متنوعة من الدراسات في الجسم الحي السابق التي تركز على الخلايا العصبية محددة ولها القدرة على عزل الخلايا لمزيد من الزراعة على المدى القصير.
Abstract
خلال عملية الشيخوخة ، تتراكم العديد من الخلايا مستويات عالية من الضرر مما يؤدي إلى خلل في الخلايا ، والتي تكمن وراء العديد من حالات الشيخوخة والمرض. تمثل الخلايا العصبية ما بعد الميكوتيك نوع خلية رئيسية تتأثر بالشيخوخة. على الرغم من وجود نماذج الثدييات متعددة من الشيخوخة العصبية، فهي صعبة ومكلفة لإنشاء. الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans هو نموذج قوي لدراسة الشيخوخة العصبية، كما أن هذه الحيوانات لديها عمر قصير، والأدوات الوراثية القوية المتاحة، والجهاز العصبي مفهرسة جيدا. الطريقة المعروضة هنا تسمح بالعزل السلس لخلايا محددة استناداً إلى التعبير عن بروتين فلورسنت أخضر المعدل وراثياً (GFP). يتم هضم خطوط الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP تحت المروجين متميزة، نوع الخلية محددة لإزالة بشرة الخارجي وتعطيل ميكانيكيا بلطف لإنتاج الطين التي تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا. ثم يتم فصل الخلايا ذات الأهمية من الخلايا غير المستهدفة من خلال فرز الخلايا المنشطة بالفلورة، أو بواسطة الخرز المغناطيسي المضاد لGFP. ويمكن بعد ذلك استزراع الخلايا المعزولة لفترة محدودة أو استخدامها على الفور لتحليل الجسم الحي السابق الخاص بالخلايا مثل التحليل النسخي عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي. وهكذا، يسمح هذا البروتوكول لتحليل سريع وقوي للاستجابات الخاصة بالخلايا داخل مجموعات الخلايا العصبية المختلفة في C. elegans.
Introduction
على مدى العقود العديدة الماضية، كان الكائن الحي النموذجي الميتازوان Caenorhabditis elegans رصيدا هائلا في دراسة الخلايا العصبية، والدوائر العصبية ودورها في الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية، والشيخوخة المرتبطة العصبية الامراض. ميزة فريدة من نوعها من C. elegans هو أن الحيوانات شفافة، مما يسمح لسلالة جميع الخلايا الجسدية الكبار ليتم تعيينها1. C. elegans أيضا يأوي كمية يمكن التحكم فيها من الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى مورفولوجيا واتصال الجهاز العصبي يجري فهمها جيدا2. سلالة الخلايا الثابتة، وعمر قصير، ووفرة من الأدوات الوراثية عالية الإنتاجية المتاحة لC. elegans تجعل من كائن حي نموذج مثالي لدراسة الشيخوخة داخل مجموعات الخلايا العصبية المختلفة.
شيخوخة الخلايا العصبية والاضطرابات العصبية معقدة، ولكل اضطراب التوقيعات المرضية فريدة من نوعها المرتبطة به. ومع ذلك، بالنسبة للعديد من هذه الاضطرابات، مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر، سمة مشتركة هي الحمل التدريجي للبروتينات غير مطوية3،4،5. في كل من هذه الأمراض، والبروتينات misfold والكلي داخل الخلية لتسبب سمية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلية4،5. للشيخوخة السليمة للخلايا العصبية ، فإن التوازن من الميتوكوندريا ، وعلى وجه التحديد التوازن البروتيني ، مهم ، كما الاضطرابات وdyshomeostasis يمكن أن يؤدي إلى تنكس الأعصاب6،7،8. وقد تم تجهيز الخلايا مع آليات مختلفة للحفاظ على التوازن البروتين، واحد هو استجابة البروتين تتكشف (الاستعراض الشامل)، وهو مسار كلاسيكي حيث إشارات من الشبكية endoplasmic (ER) تنشيط تتالي الإشارات داخل الخلايا، مما يؤدي إلى النسخ الرد9. أقرب إلى هذا النظام الشاملER، metazoans عرض استجابة مماثلة لفقدان التوازن البروتين الميتوكوندريا ، ما يسمى الميتوكوندريا UPR (UPRMT)7،8. C. elegans يبدو أن الكائن الحي القاعدية الأكثر أن يكون مؤكد ومحدد جيدا مسارMT التقارير UPR7.
وظيفة / خلل السكان الخلايا العصبية محددة داخل شبكة أكبر يمكن أن يكون من الصعب تقييم بسبب اتصالها الجوهرية والتعقيد3. ومع ذلك، غالباً ما تكون هناك حاجة لدراسة مجموعات الخلايا العصبية المتميزة بسبب الأمراض الخاصة بنوع الخلية مع الأمراض المعقدة، مثل تلك المرتبطة بضعف توازن البروتين الخلوي. في C. elegans, يمكن التلاعب بمجموعات الخلايا العصبية المحددة وراثيا مما يسمح بالمراقبة السهلة في الجسم الحي. الجهاز العصبي من C. elegans يتكون في المقام الأول من الخلايا العصبية ، مع نسبة صغيرة من الخلايا الدبقية. في الديدان hermaphrodite الكبار، وهناك ما يقرب من 302 الخلايا العصبية، مقسمة إلى أكثر من 100 فئات مختلفة2،10. الخلايا العصبية مثل الخلايا العصبية الكولينية تهيمن في تقاطعات العصبية العضلية، في حين تشارك الخلايا العصبية الدوبامين في المقام الأول في الإحساس10،11. كما كل من النشاط الحركي والقدرات الحسية تنخفض مع التقدم في السن، فمن المهم أن تفاصيل الرؤى الميكانيكية حول العيوب في هذه الخلايا العصبية الفردية11،12. على هذا النحو، هناك حاجة إلى طريقة بسيطة وقوية لعزل الخلايا السليمة ذات الأهمية للدراسات اللاحقة في الجسم الحي السابق.
هنا، ونحن نصف طريقة فعالة الأمثل للعزل السريع للخلايا العصبية محددة تعبر عن البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) من C. elegans. ويمكن إجراء طريقة العزل هذه على الديدان اليرقات أو الأحداث أو البالغين. وقد سبق أن نشر تشانغ وآخرونعزل الخلايا عن الديدان اليرقانية ولن تناقش هنا. ملاحظة هامة هنا هو أن جميع الديدان تحتاج إلى أن تكون في نفس مرحلة الحياة لمنع الإفراط في الهضم من الحيوان أو التلوث من الحيوانات في مراحل الحياة المختلفة. من خلال كل من اضطراب الأنزيمية والميكانيكية من بشرة الديدان الخيطية، وهو هيكل خارجي عالية في الكولاجين والبروتينات الهيكلية الأخرى، يمكن عزل مجموعة واسعة من الخلايا13،14. ثم يمكن عزل الخلايا عن طريق قياس التدفق المقطعي أو الأجسام المضادة المسماة الخرز المغناطيسي. عادة، يتم عزل الحمض النووي الريبي عن طريق طريقة الفينول وانييدين إيزوثيوسينات لضمان إثراء السكان الخلية المطلوب15. مع الكثير من الرعاية يمكن الحفاظ على هذه الخلايا المعزولة في قارورة الثقافة أو طبق متعدد الآبار. هذه الطريقة تمثل أداة فريدة وقوية في دراسة الخلايا العصبية محددة ولها القدرة على عزل الخلايا الحية والوظيفية لمزيد من الزراعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الدودة المستديرة C. elegans هو نموذج راسخة وقوية لدراسة صحة الخلايا العصبية والمرض2. مع أدوات وراثية وافرة للتعامل مع هذه الحيوانات وكمية يمكن التحكم فيها من أنواع الخلايا العصبية المختلفة التي تم تعيينها بدقة، يمكن جمع قدر كبير من البيانات مع كمية صغيرة نسبيا من المواد. هنا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة جنيفر فوكس وأعضاء مختبر خاليمونشوك على التعليقات الثاقبة. ونحن نعترف بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM108975 إلى O.K. و T32 GM107001-01A1 إلى E.M.G.).
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
- Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
- Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
- Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
- Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
- Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
- Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
- Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
- Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).
