דיאטה ללא דם ליתושים Anopheline אחוריים
Summary
פרוטוקול מוצג לניסוח של דיאטה מלאכותית ללא דם כדי להאכיל אנופלס יתושים בשבי. דיאטה זו יש ביצועים דומים דם בעלי חוליות ומפעיל oogenesis והתבגרות ביצה ומייצרת צאצאי מבוגרים קיימא.
Abstract
מחקר מלריה דורש גידול בקנה מידה גדול ותנאי ייצור עבור יתושים (אנופלס spp.) בשבי. הייצור האמין והבר-קיימא של היתושים מעוכב כיום על ידי אספקת דם טרי בעלי חוליות. חלופות לדם נדרשות לקדם אסטרטגיות בקרה יעילות למלריה ומחלות וקטוריות אחרות המועברות על ידי חרקים מזינים בדם. עם זאת, תזונה נוזלית מלאכותית גובשה כתחליף לדם של בעלי חוליות טרי. כאן אנו מדווחים על דיאטה נוזלית מלאכותית נטולת דם המספקת שיעורי האכלה דומים לדם ומחקה את ההשפעות הפיזיולוגיות של ארוחה טרייה בעלי חוליות דם. הדיאטה גורמת התבגרות השחלות הביצית של יתושים אנופלס וגם מייצרת זחל הישרדות טוב ופיתוח של מבוגרים פונקציונליים. דיאטה נוזלית ללא דם הוא מקדמה חשובה לקראת גידול יתושים בר קיימא בשבי, תפחית את עלויות תחזוקה של מושבות יתושים ולחסל את הצורך בדם בעלי חוליות טריים.
Introduction
מחלות וקטוריות המועברות להשפיע על כמה מיליוני בני אדם ברחבי העולם ולגרום למיליוני מקרי מוות מדי שנה. הם מועברים על ידי חרקים נגועים במחלות המייצרות מחלות (פרוטוזוזה, וירוסים) רכשה כאשר הם ניזונים מדם מארח נגוע. לאחר מכן, וקטור נגוע יעביר את הפתוגן לפונדקאי חדש במהלך הארוחה הדם הבאה. מלריה היא המחלה הקטלנית המועברות וקטור המועבר על ידי מינים שונים של אנופלס יתוש ומשפיע על 40% של אוכלוסיית העולם1. הטפיל הפרוטיסטים של המלריה אחראי על יותר מ-400,000 מקרי מוות מדי שנה, שרובם ילדים מתחת לגיל 5 (ארגון הבריאות העולמי). היתוש אנופלס נקבה מעביר את הטפיל מלריה של סוג פלסטלינה בין בני אדם ובעלי חיים אחרים כאשר הוא ניזון דם בעלי חוליות, צעד הכרחי לייצור ביצים ופיתוח2.
האסטרטגיות הנוכחיות למיגור מלריה ועוד מחלות קטלניות המתעוררים וקטור קטלני להסתמך על פיתוח אסטרטגיות בקרת יתושים חדשניים3,4,5, אשר כוללים את השחרור לתוך פראי של מספר גדול של יתושים שנולדו insectaries. עם זאת, גורם מגביל הכרחי הוא התלות על אספקת דם טרי לגידול יתושים יעיל ורבייה. הרכב משתנה של דם בעלי חוליות יכול להשפיע לרעה פוריות היתושים וכושר צאצאני יכול להגביל את האמינות ואת הקיימות של מושבות רבייה בשבי. שחרור נגד יתושים ותוכניות בקרה דורשים מערכות ייצור יתושים גדולות ואספקה קבועה של כמויות גדולות של דם בעלי חוליות. זהו מכשול גדול לייצור יתושים ומעלה סדרה של סוגיות אתיות הקשורות לשימוש בבעלי חיים חיים ומגבלות לוגיסטיות הנגרמות על ידי תקנות הבטיחות התובעניות הקשורות. זה הופך את העלויות של תחזוקה וביטחון של מושבות יתושים גבוה ואתגרים את הקיימות של שיטות גידול יתושים הנוכחי במיוחד במדינות הכנסה נמוכה שבה האיום של מלריה הוא הרבה יותר גדול.
מחקר לאחרונה התמקד בפיתוח תחליפי דם המחקים ארוחה דם בעלי חוליות אבל עד כה, רק הצלחה מוגבלת הושגה6,7,8,9. תזונה מלאכותית מוצלחת צריך (1) לעורר מלאה יתוש הנקבה engorgement שחתה, (2) ההדק vitellogenin הייצור, (3) לייצר אצוות גדולות של ביצים קיימא, ו (4) ליצור הראש שלך10. בנוסף, דיאטות מלאכותיות יש הרכב רגיל, ולכן הם אמינים יותר לייצור של יתושים למטרות מחקר ובקרה. דיאטות מוצלחות ללא דם פותחו עבור יתושים aedes (נבדקו על ידי גונזלס והנסן11) אבל לא עבור אנופלס spp. דיאטות מלאכותיות קיימות מכילות phagostimulant מריצים (לדוגמה, ATP10), מקור חלבון להבשלה ביצים6,12, פחמימות כמקור אנרגיה, וחומצות אמינו (aa)13 הבסיסיות לייצור ביצים ומהוות גורם מגביל גדול לפוריות היתושים14. דיאטה מלאכותית ללא תשלום גם צריך לספק כולסטרול15, אשר משפר את ייצור ביצים. כאן אנו מתארים דיאטה מלאכותית ללא דם עבור יתושים אנופלס הנשי ולהדגים כי יש לו ביצועים עקביים ושווי ערך לארוחת דם באיכות גבוהה בעלי חוליות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההצלחה של דיאטה ללא דם שלנו היא כנראה תוצאה של ההשפעה הפיזיולוגית הסינרגיה של כל הרכיבים שנוספו ל-i-liq_diet (עשיר בסוכר, חומצות אמינו, ויטמינים מיקרואלמנטים): BSA (מקור החלבון), ATP (phagostimulant) ו כולסטרול (מקור השומנים). תוספי ה-r-liq_diet עם הרכיבים הבודדים בלבד לא היו יעילים בעירור ייצור ביצים (נתונים לא מוצגים). חיסרון אחד של הפרוטוקול עשוי להיות העלות של חלק מהרכיבים, כגון כולסטרול. למרות זאת, נוכחותו היא בסיסית, כמו חרקים אינם מסוגלים לסנתז את זה19 ומולקולה זו היא המקודמת של ההורמונים ecdysteroid לווסת סינתזה החלמון והתבגרות ביצהפרוקי רגליים. כמויות נמוכות יותר של כולסטרול צריך להיבדק על מנת לייעל את הכמות הדרושה במטרה לצמצם עלויות ולהגדיל את היתרונות של הדיאטה המלאכותית.
מגבלה נוספת של השיטה היא כי הדיאטה המלאכותית צריך להיות טרי מוכן מפתרונות מניות, כפי שהוכן פעם בצורתו האחרונה נוזל היא מאבדת איכות לאחר האחסון. בעתיד הדיאטה הגובשה שלנו יכול להיות מוכן ככוח מיובש, בדומה לצ, החלפת ארוחה מלאכותית לארוחת דם עבור יתושים Ades איג’אגיפטti 21.
לצד אספקת החומרים המזינים הדרושים, ארוחה מלאכותית צריך למשוך ולעורר יתושים נקבה להאכיל באותו אופן כמו כאשר הם ניזונים בעלי חוליות דם טרי. דיאטה נטולת דם מלאכותית במסמך זה תיאר הביא לעלייה 20% היתושים הנשי המלא כאשר לעומת הקבוצה דם המזון בעלי החוליות. זה מדידה עקיפה של האטרקציה יכול להיות מובהר עוד יותר באמצעות olfactomטומטריים כדי לאשר את הדיאטה המלאכותית הוא אטרקטיבי יותר ומושך יותר יתושים מאשר דם טרי.
ההשפעה הגבוהה ביותר של הדיאטה על תמותת הזחל נצפתה עבור הזחלים הנובעים יתושים הניזונים מדם, הרומז כי תזונה מלאכותית של הרכב יציב יכול לתרום כדי להפחית את התמותה ולשפר את ההצלחה רבייה היתושים בהשוואה לדם טרי. התוצאה הצפויה פחות של ארוחה דם עשויה לנבוע וריאציות מארחים בקומפוזיציה17 והנוכחות בדם של מולקולות שעלולות להפריע לפיזיולוגיה של היתושים22. העובדות הקודמות מדגישות את היתרונות לגידול יתושים באיכות גבוהה של דיאטות טריות מהדם.
באופן כללי המספר הממוצע של ביצים הניח במחקר שלנו היה נמוך יחסית לאלה שדווחו כמה insectaries, אבל מספר ממוצע של ביצי ההטלה היה דומה מאמץ מעבדה -גדל המורק האכיל על דם אנושי (22.6 ± 5.5 ביצים/נקבה)23. לא נצפו הבדלים סטטיסטיים משמעותיים בין הקבוצות הנסיוניות שלנו שהואכלו על דם טרי או על הארוחות המלאכותי (שולחן 2), הטוענת כי היישום של מערכות האכלה מלאכותית של ממברנה עם הדיאטה שלנו ניסח מספיק כדי לשמור ולהפיץ אנופלס מושבות יתוש בשבי.
ארוחות מלאכותיות ללא דם יכול לשמור על המושבות Aedes 22, אבל כאשר מוחל על יתושים אנופלס הם מוגבלים או לא הצלחה11. לאחרונה, ארוחה מלאכותית מבוססת פלזמה עבור יתושים אנופלס תוארה24 אבל שיעורי האכלה ופוטנציאל הרבייה היה נמוך. התוצאות שלנו מייצגות מקדמה משמעותית במדינה-of-art (שנבדקו על ידי גונזלס ו האנסן11) כמו שלנו ניסח r-liq_diet היה ביצועים דומים או טובים יותר מאשר הארוחה הסטנדרטית בעלי חוליות דם. שיפורים נוספים על יציבות האחסון והעלות צריכים להרחיב את היקף יישומו.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
היינו רוצים להודות Dinora Lopes (IHMT-נובה מתקן בעלי חיים) לתמיכה טכנית, Joana גומז ואנה קתרינה Alves (IHMT-נובה מתקן הקברות) לשמירה על מושבות יתוש אנופלס . ממומן על ידי בסיס ביל ומלינדה גייטס (OPP1138841), הנופש בסדר היום הטוב ביותר (UID/רב/04413/201, UID/רב/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383 | |
| BSA-Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A790G | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 199342 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
| Entellan mounting medium | Merck | 1079610100 | |
| Glassfeeder | Local glazier | by design | |
| Heparin Sodium Salt | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
| Imalgène 1000 | Merial, Portugal | 01MER122 | |
| Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle | Terumo Europe | NN-2025R | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
| Rompun | Bayer, Portugal | 7427831 | |
| Sterilization Millex-HV 0,45 | Millipore | SLHVR25KS | |
| Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
| Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
| Tetra Goldfish Flakes | Tetra | 4004218742642 |
References
- WHO. . World Malaria Report. , (2016).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Frontiers in Physiology. 5, 103 (2014).
- Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. Transgenic technologies to induce sterility. Malaria Journal. 8, 7 (2009).
- Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. J. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, 2 (2009).
- Lacroix, R., et al. Open Field Release of Genetically Engineered Sterile Male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS One. 7, 42771 (2012).
- Lea, A. O., Knierim, J. A., Dimond, J. B., Delong, D. M. A Preliminary Note on Egg Production from Milk-Fed Mosquitoes. The Ohio Journal of Science. 55, 1-21 (1955).
- Kogan, P. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27, 709-712 (1990).
- Griffith, J. S., Turner, G. D. Culturing Culex quinquefasciatus mosquitoes with a blood substitute diet for the females. Medical and Veterinary Entomology. 10, 265-268 (1996).
- Jason Pitts, R. A blood-free protein meal supporting oogenesis in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Skuse). Journal of Insect Physiology. 64, 1-6 (2014).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial Diets for Mosquitoes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), 1267 (2016).
- Cosgrove, J. B., Wood, R. J. Effects of variations in a formulated protein meal on the fecundity and fertility of female mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 10, 260-264 (1996).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. -. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signalling during mosquito reproduction. Journal of Experimental Biology. 209, 3071-3078 (2006).
- Clements, A. N. . The biology of mosquitoes: Development, nutrition, and reproduction. , (1992).
- Talyuli, O. A., et al. The use of a chemically defined artificial diet as a tool to study Aedes aegypti physiology. Journal of Insect Physiology. 83, 1-7 (2015).
- Lopes, L. F., Abrantes, P., Silva, A. P., Dorosario, V. E., Silveira, H. Plasmodium yoelii: The effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi. Experimental Parasitology. 115, 259-269 (2007).
- Phasomkusolsil, S., et al. Maintenance of mosquito vectors: effects of blood source on feeding, survival, fecundity, and egg hatching rates. Journal of Vector Ecology. 38, 38-45 (2013).
- Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region). Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1 (1968).
- Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. Fat metabolism in insects. Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).
- Clifton, M. E., Noriega, F. G. The fate of follicles after a blood meal is dependent on previtellogenic nutrition and juvenile hormone in Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 58, 1007-1019 (2012).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8, 11023 (2018).
- Vodovotz, Y., Zamora, R., Lieber, M. J., Luckhart, S. Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria. Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).
- Sumba, L. A., et al. Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates. Journal of Circadian Rhythms. 2, 6 (2004).
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142 (2017).
