In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü
Summary
Makrofajlar, özellikle birincil makrofajlar, kendi kendine kökenli olmayan molekülleri tespit etmede uzmanlaşdıkları için transfect yapmak zordur. Plazmidler gibi DNA şablonlarından oluşturulan mRNA ile birincil makrofajların yüksek verimli transfeksiyonuna olanak tanıyan bir protokolü tanımlıyoruz.
Abstract
Makrofajlar, kendine özgü olmayan molekülleri tespit etmede uzmanlaşmış fagositik hücrelerdir. Bu amaçla, onlar desen tanıma reseptörleri büyük bir dizi ile donatılmıştır (PRRs). Ne yazık ki, bu da transfection reaktif ve transfected nükleik asitler genellikle non-self olarak PrRs tarafından tanınan olarak transfect özellikle zor makrofajlar yapar. Bu nedenle transfeksiyon genellikle makrofaj aktivasyonu ve transfected nükleik asitlerin bozulması ve hatta makrofajların intiharı ile sonuçlanır. Burada, periton makrofajları (PM) ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM) gibi mRNA in vitro plazmidler gibi DNA şablonlarından transkripsiyonu ile yüksek verimli transföyt sağlayan bir protokol açıklıyoruz. Bu basit protokol ile PM için yaklaşık %50-65, BmDM için ise yaklaşık %85 transfeksiyon oranları sitotoksisite veya immünojenite gözlenmeden elde edilir. Plazmidler ve transfeksiyon prosedürü gibi DNA yapılarından transfeksiyon için mRNA üretimini ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Introduction
Makrofajlar, mikropları, apoptotik hücreleri ve hücresel enkazı tespit etme, sindiren ve alçaltma konusunda uzmanlaşmış fagositik hücrelerdir. Ayrıca, sitokinler ve kemokinler salgılayarak ve T hücreleri ve B hücrelerine antijenler sunarak bağışıklık yanıtları düzenlemek için yardımcı olur. Makrofajlar aynı zamanda yara iyileşmesi, ateroskleroz, tümörigenez ve obezite gibi birçok diğer süreçlerde de önemli rol oynarlar.
Patojenle ilişkili moleküler desenler (PAMP’ ler) ve hasarla ilişkili moleküler desenler (DAMP’ ler) gibi yersiz molekülleri tespit edebilmek için makrofajlar geniş bir dizi örüntü tanıma reseptörü (PRR)1ile donatılmıştır. Ne yazık ki, bu da transfeksiyon reaktifi olarak transfect2 özellikle zor makrofajlar yaparve transfected nükleik asitler4,5,6,7 genellikle non-self olarak PrRs tarafından kabul edilmektedir. Bu nedenle, makrofajların kimyasal veya fiziksel yöntemlerle transfeksiyonugenellikle makrofaj aktivasyonu ve transfekte nükleik asitlerin bozulması ve hatta piroptoz yoluyla makrofaj intiharı ile sonuçlanır, dna veya yabancı RNA9gibi sitosolik PAMP’lerin/DAMP’ların tanınmasından sonra tetiklenen programlanmış litik hücre ölümü formu. Vektörler gibi adenovirüs veya lentiviruses gibi virüsler kullanarak makrofajlar biyolojik transfeksiyon genellikle daha verimli, henüz bu tür viral vektörlerin inşaat zaman alıcı ve biyogüvenlik seviyesi 2 ekipmangerektirir 10,11.
Bu nedenle, makrofajlar yoğun araştırma konusu olmasına rağmen, moleküler düzeyde işlevlerinin analizi engellenir çünkü moleküler biyolojinin en önemli araçlarından biri olan nükleik asit infeksiyonu eksojen ifade için proteinler, pek uygulanabilir. Bu genellikle araştırmacıları iyi niyetli makrofajlar yerine makrofaj benzeri hücre hatlarını kullanmaya zorlar. Nükleik asit yapı transfeksiyonu için uygulamalar mutasyona uğramış veya etiketlenmiş protein versiyonlarının ekspresyonu, belirli bir proteinin aşırı ekspresyonu, ilgili nakavt arka planında proteinin yeniden ekspresyonu ve diğer türlerden proteinlerin ekspresyonu (örn. , Cre rekombinaz veya hedeflenen gen nakavt için RNA ve Cas9 kılavuzu).
Burada, plazmidler gibi DNA şablonlarından üretilen mRNA ile mRNA ile mrna peritoneal makrofajlar (PM) ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM) gibi birincil makrofajların (genellikle transfect zor) yüksek verimli transfeksiyon sağlayan bir protokol açıklar. Daha da önemlisi, bu protokol kullanılarak oluşturulan in vitro transkripsiyonlu mRNA, immünjeniteyi azaltan ve stabiliteyi artıran 5-metil-CTP ve psödo-UTP içeren doğal olarak modifiye edilmiş nükleozitler içerir4,6,7,12,13. Ayrıca, in vitro transkripsiyonu mRNA 5 ‘-uçları RIG-I kompleksi14,15tarafından tanınmasını önlemek için Antarktika fosfataz tarafından defosforile vardır. Bu in vitro transkripsiyonlu mRNA doğuştan bağışıklık tanıma en aza indirir. Kolay icra edilen protokolümüzle transfeksiyon oranları %50-65 (periton makrofajları (PM)) ve %85 (BMDM) arasında, daha da önemlisi sitotoksisite veya immünojenite gözlenmez. Transfeksiyon için immünolojik olarak susturulan mRNA’nın plazmidler ve (ii) transfeksiyon prosedürü nün kendisi gibi DNA yapılarından nasıl üretilebileceğini ayrıntılı olarak (i) açıklarız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada in vitro transkripsiyonu mRNA ile genellikle transfect primer makrofajların yüksek verimli transfeksiyonu için bir protokol salıyoruz. Daha da önemlisi, bu protokolü kullanarak makrofajların transfeksiyonu hücre ölümüne neden olmaz veya proinflamatuar sinyali aktive etmez ve transfeksiyon reaktifinin veya transfected mRNA’nın kendi kendine tanınmadığını gösterir.
Bu protokolü kullanarak makrofajların başarılı bir şekilde transfeksiyonu için mRNA’nın kalitesi ç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 5-methyl-CTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1138S | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase | New England BioLabs | M0289 | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) | New England BioLabs | B0289 | stored at -20 °C |
| anti-NEMO/IKKγ antibody | Invitrogen | MA1-41046 | stored at -20 °C |
| anti-β-actin antibody | Sigma-Aldrich | A2228 | stored at -20 °C |
| Petri dishes 92,16 mm with cams | Sarstedt | 821,473 | stored at RT |
| CD11b Microbeads mouse and human | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | stored at 4 °C |
| Cre recombinase + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C |
|
| Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C |
|
| DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | stored at RT |
| eGFP + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C |
|
| eGFP + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C |
|
| Fast Digest buffer (10X) | Thermo Scientific | B64 | stored at -20 °C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | stored at -20 °C |
| high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | stored at -20 °C |
| IKKβ + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C |
|
| IKKβ + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C | |
| in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) | New England BioLabs | E2060 | stored at -20 °C |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | stored at RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | stored at RT |
| mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | stored at 4 °C |
| Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid | Addgene | 11105 | stored at -20 °C |
| Mutant NEMOC54/347A plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
| pEGFP-N3 plasmid | Addgene | 62043 | stored at -20 °C |
| poly(I:C) | Calbiochem | 528906 | stored at -20 °C |
| pPGK-Cre plasmid | F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C | ||
| pseudo-UTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1139S | stored at -20 °C |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | stored at RT |
| Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated | BioLegend | 101212 | stored at 4 °C |
| Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated | eBioscience | 12-4801-82 | stored at 4 °C |
| recombinant M-CSF | Peprotech | 315-02 | stored at -20 °C |
| RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | stored at 4 °C |
| RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | stored at RT |
| ultrapure LPS from E.coli O111:B4 | Invivogen | stored at -20 °C | |
| Wild type IKKβ plasmid | Addgene | 11103 | stored at -20 °C |
| Wild type NEMO plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
References
- Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
- Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
- Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
- Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
- Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
- Hornung, V., et al. 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
- Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
- Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
- Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).
