インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション
Summary
マクロファージ、特に一次マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化しているため、トランスフェクトに挑戦しています。プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いた一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。
Abstract
マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化した貪食細胞です。この用に、それらはパターン認識受容体(PRR)の大きな配列を備えている。残念ながら、これはまた、トランスフェクション試薬としてトランスフェクトに特に困難なマクロファージを作り、トランスフェクトされた核酸は、多くの場合、非自己としてPRRによって認識されます。したがって、トランスフェクションは、多くの場合、トランスファージの活性化とトランスフェクション核酸の分解、あるいはマクロファージの自殺をもたらす。ここでは、腹腹マクロファージ(PM)や骨髄由来マクロファージ(BMDM)などのマウス一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルを、プラスミドなどのDNAテンプレートから転写したmRNAを用いて説明する。この単純なプロトコルを使用すると、PMのトランスフェクション率は約50〜65%、BMDMのトランスフェクション率は、細胞傷害性または免疫原性が観察されずに達成される。プラスミドなどのDNA構築物からのトランスフェクションのためのmRNAの生成とトランスフェクション手順について詳しく説明する。
Introduction
マクロファージは、微生物、アポトーシス細胞、細胞破片の検出、摂取、分解に特化した貪食細胞です。さらに、サイトカインやケモカインを分泌し、T細胞やB細胞に抗原を提示することで免疫応答を調整するのに役立ちます。マクロファージはまた、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、腫瘍形成および肥満のような他の多くのプロセスにおいて重要な役割を果たす。
病原体関連分子パターン(PAMP)や損傷関連分子パターン(DamP)などの場外分子などの非自己分子を検出できるように、マクロファージは、大きなパターン認識受容体(PRR)1を備えている。残念ながら、これはまた、トランスフェクション試薬3およびトランスフェクト核酸4、5、6、7としてトランスフェクト2に特に困難なマクロファージを作り、多くの場合、PrRによって非自己として認識される。このため、化学的または物理的方法8を用いたマクロファージのトランスフェクションは、通常、トランスフェクトされた核酸のマクロファージ活性化および分解、あるいはピロ球症を介したマクロファージ自殺においても、DNAまたは外来RNA9などのサイトソリックPamPs/Dammpの認識後に引き起こされるプログラムされた溶解細胞死の形態をもたらす。アデノウイルスやレンチウイルスなどのウイルスをベクターとして用いたマクロファージの生物学的トランスフェクションは、より効率的であることが多いが、そのようなウイルスベクターの構築には時間がかかり、バイオセーフティレベル2装置10、11を必要とする。
したがって、マクロファージは集中的な研究の対象であるが、分子生物学の最も重要なツールの一つである、発出性発現のための核酸構築物のトランスフェクションにより、分子レベルにおけるその機能の解析が妨げられる。タンパク質は、ほとんど適用できない。これはしばしば、研究者がボナ・フィデス・マクロファージではなくマクロファージ様細胞株を使用することを強制する。核酸構築トランスフェクションのアプリケーションには、変異またはタグ付けされたタンパク質バージョンの発現、特定のタンパク質の過剰発現、それぞれのノックアウトバックグラウンドでのタンパク質再発現および他の種からのタンパク質の発現(例えば.、クレリコンゲナーゼまたはガイドRNAおよびCas9を標的遺伝子ノックアウト用)。
ここでは、プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いたマウス腹蓋マクロファージ(PM)および骨髄由来マクロファージ(BMDM)である一次マクロファージの非常に効率的なトランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。重要なことに、このプロトコルを用いて生成されたインビトロ転写mRNAには、免疫原性を低下させ、安定性を高める天然の修飾ヌクレオシド5-メチル-CTPおよび擬似UTPが含まれており、安定性を高める4、6、7、12、13である。また、インビトロ転写mRNAの5’末端は、RIG-I複合体14、15による認識を防止するために南極ホスファターゼによって脱リン酸化される。これは、インビトロ転写mRNAの自然免疫認識を最小限に抑える。プロトコルを実行しやすいので、トランスフェクション率は50~65%(腹蓋マクロファージ(PM))~85%(BMDM)に達し、重要なことに、細胞傷害性や免疫原性は認められません。(i)トランスフェクション用の免疫学的に沈黙したmRNAが、プラスミドや(ii)トランスフェクション手順そのものなどのDNA構築物からどのように生成できるかを詳しく説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、インビトロ転写mRNAを用いた通常はトランスフェクト性の高い一次マクロファージの非常に効率的なトランスフェクションのためのプロトコルを提示する。重要なことに、このプロトコルを用いたマクロファージのトランスフェクションは、細胞死を誘導したり、トランスフェクション試薬もトランスフェクトされたmRNAも非自己として認識されていないことを示す炎症シグナル伝?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はドイツ・フォルシュチュングゲマイインシャフト(SFB 670)によって支えられた。
Materials
| 5-methyl-CTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1138S | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase | New England BioLabs | M0289 | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) | New England BioLabs | B0289 | stored at -20 °C |
| anti-NEMO/IKKγ antibody | Invitrogen | MA1-41046 | stored at -20 °C |
| anti-β-actin antibody | Sigma-Aldrich | A2228 | stored at -20 °C |
| Petri dishes 92,16 mm with cams | Sarstedt | 821,473 | stored at RT |
| CD11b Microbeads mouse and human | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | stored at 4 °C |
| Cre recombinase + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C |
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| Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C |
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| DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | stored at RT |
| eGFP + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C |
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| eGFP + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C |
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| Fast Digest buffer (10X) | Thermo Scientific | B64 | stored at -20 °C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | stored at -20 °C |
| high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | stored at -20 °C |
| IKKβ + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C |
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| IKKβ + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C | |
| in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) | New England BioLabs | E2060 | stored at -20 °C |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | stored at RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | stored at RT |
| mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | stored at 4 °C |
| Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid | Addgene | 11105 | stored at -20 °C |
| Mutant NEMOC54/347A plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
| pEGFP-N3 plasmid | Addgene | 62043 | stored at -20 °C |
| poly(I:C) | Calbiochem | 528906 | stored at -20 °C |
| pPGK-Cre plasmid | F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C | ||
| pseudo-UTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1139S | stored at -20 °C |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | stored at RT |
| Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated | BioLegend | 101212 | stored at 4 °C |
| Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated | eBioscience | 12-4801-82 | stored at 4 °C |
| recombinant M-CSF | Peprotech | 315-02 | stored at -20 °C |
| RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | stored at 4 °C |
| RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | stored at RT |
| ultrapure LPS from E.coli O111:B4 | Invivogen | stored at -20 °C | |
| Wild type IKKβ plasmid | Addgene | 11103 | stored at -20 °C |
| Wild type NEMO plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
References
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