העברה יעילה במיוחד של מקרופאגים ראשוניים עם מחוץ לגופית
Summary
מקרופאגים, במיוחד מקרופאגים ראשוניים, מאתגרים transfect כפי שהם מתמחים בזיהוי מולקולות של מוצא לא עצמי. אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של מקרופאגים הראשי עם mRNA שנוצר מתבניות DNA כגון פלמידים.
Abstract
מקרופאגים הם תאים phagocytic מתמחה בזיהוי מולקולות של מוצא לא עצמי. למטרה זו, הם מצוידים במערך גדול של קולטני זיהוי תבנית (PRRs). למרבה הצער, זה גם עושה מקרופאגים מאתגרת במיוחד כדי transfect כמו מגיב החצייה ואת חומצות גרעין מנוכר מוכרים לעתים קרובות על ידי PRRs כמו לא עצמי. לכן, העברה החוצה גורמת לעתים קרובות מקרופאג הפעלה והשפלה של חומצות גרעין מנוכר או אפילו בהתאבדות של מקרופאגים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של מקרופאגים ראשוניים מורטין כגון מקרופאגים הצפק (PM) ו מח עצם הנגזר מקרופאגים (BMDM) עם mRNA בתוך מבחנה מתוך תבניות DNA כגון פלמידים. עם הפרוטוקול הפשוט הזה, שיעורי ההעברה של כ 50-65% עבור PM ו-85% עבור BMDM מושגת ללא רעילות ציטוזה או החיסוני נצפתה. אנו מתארים בפרוטרוט את הדור של mRNA עבור העברה של מבנים DNA כגון פלמידים והליך החצייה.
Introduction
מקרופאגים הם תאים phagocytic המתמחים זיהוי, בליעת חיידקים משפיל, תאים אפוטוטיים ופסולת הסלולר. יתר על כן, הם עוזרים לארגן את התגובות החיסונית על ידי הפרשה ציטוקינים ו נוגדנים ועל ידי הצגת אנטיגנים לתאי T ו-B תאים. המקרופאגים גם לשחק תפקידים חשובים בתהליכים אחרים רבים, כגון ריפוי הפצע, טרשת עורקים, tuמוריגנזה והשמנה.
כדי להיות מסוגל לזהות מולקולות שאינן עצמיות כגון דפוסי מולקולרי הקשורים לפתוגן (PAMPs) ומולקולות מחוץ למקום כגון דפוסי נזק מולקולריים (DAMPs), מקרופאגים מצוידים במערך גדול של קולטני זיהוי תבנית (PRR)1. למרבה הצער, זה גם עושה מקרופאגים מאתגרת במיוחד כדי transfect2 כמו מגיב החצייה3 ואת חומצות גרעין מנוכר4,5,6,7 לעתים קרובות מוכרים על ידי prrs כמו לא עצמי. מסיבה זו, העברה של מקרופאגים באמצעות שיטות כימיות או פיזיות8 בדרך כלל גורמת הפעלה מקרופאג והשפלה של חומצות גרעין מזוהמים או אפילו ב מקרופאג התאבדות דרך פירופציטוזה, צורה של מוות תאים מתוכנת lytic המופעל לאחר הכרה של pמגברים ציטופולימרים/damps כגון DNA או זרים RNA9. העברה ביולוגית של מקרופאגים באמצעות וירוסים כגון אדנוירוסים או וירוסים כמו וקטורים הוא לעתים קרובות יעיל יותר, אך הבנייה של וקטורים ויראליות כגון הוא זמן רב ודורש ברמה אבטחה טיחות 2 ציוד10,11.
כך, למרות מקרופאגים הם הנושא של מחקר אינטנסיבי, ניתוח התפקודים שלהם על הרמה המולקולרית היא הכשלה כי אחד הכלים החשובים ביותר של ביולוגיה מולקולרית, הגלגול של חומצות גרעין בנייה לביטוי אקסוגני של חלבונים, בקושי ישימה. זה לעתים קרובות כוחות חוקרים להשתמש קווי תאים מקרופאג כמו במקום מקרופאגים בתום הכוח. יישומים עבור חומצות גרעין בניית המבנה כוללים ביטוי של גירסאות חלבון מוטציה או מתויג, הבעות יתר של חלבון מסוים, חלבון מחדש ביטוי ברקע נוקאאוט בהתאמה וביטוי של חלבונים ממינים אחרים (g. , היצור recombinase או מדריך RNA ו Cas9 עבור הסתרה המוקד הגן).
כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של (בדרך כלל קשה transfection) מקרופאגים ראשוניים, כי הוא murine הצפק מקרופאגים (PM) ו מח עצם נגזר מקרופאגים (BMDM) עם mRNA שנוצר מ-DNA תבניות כגון פלמידים. חשוב לעשות זאת, בתוך מבחנה מחוץ לגופית mrna שנוצר באמצעות פרוטוקול זה מכיל את נוקלאוטידים באופן טבעי משתנה 5-מתיל-ctp ו פסאודו-utp כי להפחית את האימונוגלוגניות ולשפר את יציבות4,6,7,12,13. יתר על כן, 5 ‘-הקצוות של ה-mrna המועתק מחוץ לחומרים מלאכותית הם deזרחנות על ידי פוספספטאז אנטארקטיקה כדי למנוע הכרה על ידי המתקן-I מורכב14,15. זה ממזער את ההכרה החיסונית הטבועה ב-mRNA מתורבת. עם שלנו קל לבצע את הפרוטוקול, שיעורי החצייה בין 50-65% (מקרופאגים הצפק (PM)) ו 85% (BMDM) הגיעו בזמן, וחשוב, אין הרעלת ציטוזה או החיסוני נצפתה. אנו מתארים בפרוטרוט (i) כיצד מושתקים החיסוני mRNA עבור החצייה ניתן להפיק מתוך מבנים DNA כגון פלמידים ו (ii) את ההליך החוצה עצמו.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור העברה יעילה מאוד של מקרופאגים הראשי בדרך כלל קשה ל-transfection עם העתק מחוץ לגופית mRNA. חשוב לציין, העברה של מקרופאגים באמצעות פרוטוקול זה לא לגרום למוות התאים או להפעיל איתות proinflammatory המציין כי לא מגיב החצייה או mRNA מנוכר מזוהים כמו לא עצמי.
איכות ה-mRNA ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה הזאת נתמכת על ידי הגרמני בפורשיגומיייסמייססביסי (SFB 670).
Materials
| 5-methyl-CTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1138S | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase | New England BioLabs | M0289 | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) | New England BioLabs | B0289 | stored at -20 °C |
| anti-NEMO/IKKγ antibody | Invitrogen | MA1-41046 | stored at -20 °C |
| anti-β-actin antibody | Sigma-Aldrich | A2228 | stored at -20 °C |
| Petri dishes 92,16 mm with cams | Sarstedt | 821,473 | stored at RT |
| CD11b Microbeads mouse and human | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | stored at 4 °C |
| Cre recombinase + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C |
|
| Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C |
|
| DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | stored at RT |
| eGFP + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C |
|
| eGFP + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C |
|
| Fast Digest buffer (10X) | Thermo Scientific | B64 | stored at -20 °C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | stored at -20 °C |
| high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | stored at -20 °C |
| IKKβ + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C |
|
| IKKβ + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C | |
| in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) | New England BioLabs | E2060 | stored at -20 °C |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | stored at RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | stored at RT |
| mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | stored at 4 °C |
| Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid | Addgene | 11105 | stored at -20 °C |
| Mutant NEMOC54/347A plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
| pEGFP-N3 plasmid | Addgene | 62043 | stored at -20 °C |
| poly(I:C) | Calbiochem | 528906 | stored at -20 °C |
| pPGK-Cre plasmid | F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C | ||
| pseudo-UTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1139S | stored at -20 °C |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | stored at RT |
| Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated | BioLegend | 101212 | stored at 4 °C |
| Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated | eBioscience | 12-4801-82 | stored at 4 °C |
| recombinant M-CSF | Peprotech | 315-02 | stored at -20 °C |
| RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | stored at 4 °C |
| RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | stored at RT |
| ultrapure LPS from E.coli O111:B4 | Invivogen | stored at -20 °C | |
| Wild type IKKβ plasmid | Addgene | 11103 | stored at -20 °C |
| Wild type NEMO plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
References
- Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
- Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
- Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
- Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
- Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
- Hornung, V., et al. 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
- Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
- Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
- Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).
