Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA
Summary
Makrophagen, insbesondere primäre Makrophagen, sind eine Herausforderung zu transfetieren, da sie sich auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden.
Abstract
Makrophagen sind phagozytische Zellen, die auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisiert sind. Zu diesem Zweck sind sie mit einer großen Auswahl an Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) ausgestattet. Leider macht dies auch Makrophagen besonders schwierig zu transfekieren, da das Transfektionsreagenz und die transfizierten Nukleinsäuren von den PRRs oft als nicht-selbst erkannt werden. Daher führt die Transfektion oft zu Makrophagenaktivierung und Abbau der transfizierten Nukleinsäuren oder sogar zum Selbstmord der Makrophagen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von murinen primären Makrophagen wie Peritonealmakrophagen (PM) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) mit mRNA in vitro aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden transkribiert ermöglicht. Mit diesem einfachen Protokoll werden Transfektionsraten von etwa 50-65% für PM und etwa 85% für BMDM erreicht, ohne dass Zytotoxizität oder Immunogenität beobachtet werden. Wir beschreiben detailliert die Generierung von mRNA für die Transfektion aus DNA-Konstrukten wie Plasmiden und dem Transfektionsverfahren.
Introduction
Makrophagen sind phagozytische Zellen, die sich auf die Erkennung, Einnahme und Erniedrigung von Mikroben, apoptotischen Zellen und zellulären Ablagerungen spezialisieren. Darüber hinaus helfen sie, Immunantworten zu orchestrieren, indem sie Zytokine und Chemokine sezernieren und Antigene t-Zellen und B-Zellen präsentieren. Makrophagen spielen auch eine wichtige Rolle in zahlreichen anderen Prozessen, wie Wundheilung, Arteriosklerose, Tumorgenese und Adipositas.
Um Nicht-Selbstmoleküle wie pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) und außerorts entfernte Moleküle wie schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) nachweisen zu können, sind Makrophagen mit einer Vielzahl von Mustererkennungsrezeptoren (PRR)ausgestattet 1. Leider macht dies auch Makrophagen besonders schwierig,um 2 zu transfekieren, da das Transfektionsreagenz3 und die transfizierten Nukleinsäuren4,5,6,7 oft von den PRRs als nicht selbst erkannt werden. Aus diesem Grund führt die Transfektion von Makrophagen mit chemischen oder physikalischen Methoden8 in der Regel zu Makrophagenaktivierung und Abbau der transfizierten Nukleinsäuren oder sogar zum Makrophagenselbstmord mittels Pyroptose, einer Form des programmierten lytischen Zelltodes, der nach Erkennung von zytosolischen PAMPs/DAMPs wie DNA oder Fremd-RNA9ausgelöst wird. Biologische Transfektion von Makrophagen mit Viren wie Adenoviren oder Lentiviren als Vektoren ist oft effizienter, aber die Konstruktion solcher viralen Vektoren ist zeitaufwändig und erfordert Biosicherheitsausrüstung der Stufe 210,11.
Obwohl Makrophagen intensiv erforscht werden, wird die Analyse ihrer Funktionen auf molekularer Ebene dadurch erschwert, dass eines der wichtigsten Instrumente der Molekularbiologie, die Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten zur exogenen Expression von Proteine, ist kaum anwendbar. Dies zwingt Forscher oft dazu, makrophagenähnliche Zelllinien anstelle von bona fide Makrophagen zu verwenden. Anwendungen für Nukleinsäurekonstrukttransfektion enzinieren die Expression mutierter oder getaggter Proteinversionen, die Überexpression eines bestimmten Proteins, die Proteinreexpression in einem entsprechenden Knockout-Hintergrund und die Expression von Proteinen anderer Arten (z. B. , Cre Recombinase oder Guide RNA und Cas9 für gezielte Gen Knockout).
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das hocheffiziente Transfektion von (in der Regel schwer zu transfekten) primären Makrophagen ermöglicht, d. h. murinen peritonealen Makrophagen (PM) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) mit mRNA, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden. Wichtig ist, dass die mit diesem Protokoll erzeugte in vitro transkribierte mRNA die natürlich vorkommenden modifizierten Nukleoside nukleoside nucleosides 5-methyl-CTP und Pseudo-UTP enthält, die die Immunogenität reduzieren und dieStabilität4,6,7,12,13. Darüber hinaus werden die 5′-Enden der in vitro transkribierten mRNA durch antarktische Phosphatase dephosphoryliert, um die Erkennung durch den RIG-I-Komplex14,15zu verhindern. Dies minimiert die angeborene Immunerkennung der in vitro transkribierten mRNA. Mit unserem einfach durchzuführenden Protokoll werden Transfektionsraten zwischen 50-65% (Peritonealmakropages (PM)) und 85% (BMDM) erreicht, während, was wichtig ist, keine Zytotoxizität oder Immunogenität beobachtet wird. Wir beschreiben detailliert (i) wie die immunologisch stumme mRNA zur Transfektion aus DNA-Konstrukten wie Plasmiden und (ii) dem Transfektionsverfahren selbst erzeugt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll zur hocheffizienten Transfektion von meist schwer transfekten primären Makrophagen mit in vitro transkribierter mRNA vor. Wichtig ist, dass die Transfektion der Makrophagen mit diesem Protokoll weder den Zelltod induziert noch die proinflammatorische Signalisierung aktiviert, was darauf hinweist, dass weder das Transfektionsreagenz noch die transfizierte mRNA als nicht-selbst erkannt werden.
Die Qualität der mRNA ist von zentraler Bedeutung für die erfolgreich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 670) unterstützt.
Materials
| 5-methyl-CTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1138S | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase | New England BioLabs | M0289 | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) | New England BioLabs | B0289 | stored at -20 °C |
| anti-NEMO/IKKγ antibody | Invitrogen | MA1-41046 | stored at -20 °C |
| anti-β-actin antibody | Sigma-Aldrich | A2228 | stored at -20 °C |
| Petri dishes 92,16 mm with cams | Sarstedt | 821,473 | stored at RT |
| CD11b Microbeads mouse and human | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | stored at 4 °C |
| Cre recombinase + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C |
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| Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C |
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| DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | stored at RT |
| eGFP + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C |
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| eGFP + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C |
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| Fast Digest buffer (10X) | Thermo Scientific | B64 | stored at -20 °C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | stored at -20 °C |
| high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | stored at -20 °C |
| IKKβ + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C |
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| IKKβ + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C | |
| in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) | New England BioLabs | E2060 | stored at -20 °C |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | stored at RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | stored at RT |
| mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | stored at 4 °C |
| Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid | Addgene | 11105 | stored at -20 °C |
| Mutant NEMOC54/347A plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
| pEGFP-N3 plasmid | Addgene | 62043 | stored at -20 °C |
| poly(I:C) | Calbiochem | 528906 | stored at -20 °C |
| pPGK-Cre plasmid | F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C | ||
| pseudo-UTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1139S | stored at -20 °C |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | stored at RT |
| Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated | BioLegend | 101212 | stored at 4 °C |
| Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated | eBioscience | 12-4801-82 | stored at 4 °C |
| recombinant M-CSF | Peprotech | 315-02 | stored at -20 °C |
| RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | stored at 4 °C |
| RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | stored at RT |
| ultrapure LPS from E.coli O111:B4 | Invivogen | stored at -20 °C | |
| Wild type IKKβ plasmid | Addgene | 11103 | stored at -20 °C |
| Wild type NEMO plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
References
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