Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro
Summary
Les macrophages, en particulier les macrophages primaires, sont difficiles à transfect car ils se spécialisent dans la détection de molécules de non-auto-origine. Nous décrivons un protocole qui permet une transfection très efficace des macrophages primaires avec l’ARNm généré à partir de modèles d’ADN tels que les plasmides.
Abstract
Les macrophages sont des cellules phagocytiques spécialisées dans la détection de molécules non auto-d’origine. À cette fin, ils sont équipés d’un large éventail de récepteurs de reconnaissance de motifs (PrR). Malheureusement, cela rend également les macrophages particulièrement difficiles à transfect que le réactif transfection et les acides nucléiques transfectés sont souvent reconnus par les PrR comme non-auto. Par conséquent, la transfection entraîne souvent l’activation et la dégradation des acides nucléiques transfectés ou même le suicide des macrophages. Ici, nous décrivons un protocole qui permet la transfection très efficace des macrophages primaires de murine tels que les macrophages péritonéaux (PM) et les macrophages marrow-dérivés de moelle (BMDM) avec ARNm in vitro transcrits des modèles d’ADN tels que des plasmides. Avec ce protocole simple, les taux de transfection d’environ 50-65% pour PM et environ 85% pour BMDM sont réalisés sans cytotoxicité ou immunogénicité observée. Nous décrivons en détail la génération de l’ARNm pour la transfection des constructions d’ADN telles que les plasmides et la procédure de transfection.
Introduction
Les macrophages sont des cellules phagocytiques qui se spécialisent dans la détection, l’ingestion et la dégradation des microbes, des cellules apoptotiques et des débris cellulaires. En outre, ils aident à orchestrer les réponses immunitaires en sécrétant des cytokines et des chemokines et en présentant des antigènes aux lymphocytes T et aux cellules B. Les macrophages jouent également un rôle important dans de nombreux autres processus, tels que la cicatrisation des plaies, l’athérosclérose, la tumorigénèse et l’obésité.
Pour être en mesure de détecter des molécules non autonomes telles que les modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et les molécules hors de place telles que les modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), les macrophages sont équipés d’un large éventail de récepteurs de reconnaissance de modèles (PRR)1. Malheureusement, cela rend également les macrophages particulièrement difficiles à transfect2 que le réactif transfection3 et les acides nucléiques transfectés4,5,6,7sont souvent reconnus par les PrR comme non-auto. Pour cette raison, la transfection des macrophages utilisant des méthodes chimiques ou physiques8 entraîne généralement l’activation et la dégradation des macrophages des acides nucléiques transfectés ou même dans le suicide par macrophage par pyroptose, une forme de mort cellulaire lytique programmée déclenchée après la reconnaissance des PAMP/DAMP cytosoliques tels que l’ADN ou l’ARN étranger9. La transfection biologique des macrophages à l’aide de virus tels que les adénovirus ou les lentivirus comme vecteurs est souvent plus efficace, mais la construction de tels vecteurs viraux prend beaucoup de temps et nécessite un équipement de niveau 2 de biosécurité10,11.
Ainsi, bien que les macrophages soient l’objet de recherches intensives, l’analyse de leurs fonctions au niveau moléculaire est entravée parce que l’un des outils les plus importants de la biologie moléculaire, la transfection des constructions d’acide nucléique pour l’expression exogène de protéines, n’est guère applicable. Cela oblige souvent les chercheurs à utiliser des lignées cellulaires semblables à des macrophages plutôt que des macrophages de bonne foi. Les applications pour la transfection de construction d’acide nucléique incluent l’expression des versions mutées ou marquées de protéine, la surexpression d’une protéine spécifique, la réexpression de protéine dans un fond askouteux respectif et l’expression des protéines d’autres espèces (par exemple. , Cre recombinase ou guide RNA et Cas9 pour le gène ko ciblé).
Ici, nous décrivons un protocole qui permet la transfection très efficace des macrophages primaires (généralement difficiles à transfect), c’est-à-dire les macrophages péritonéaux de la murine (PM) et les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) avec l’ARNM généré à partir de modèles d’ADN tels que les plasmides. Fait important, l’ARNm transcrit in vitro généré à l’aide de ce protocole contient les nucléosides modifiés naturels 5-méthyl-CTP et pseudo-UTP qui réduisent l’immunogénicité et améliorent la stabilité4,6,7,12,13. En outre, les 5′-extrémités de l’ARNm transcrit in vitro sont déphosphorylées par la phosphatase antarctique pour empêcher la reconnaissance par le complexe RIG-I14,15. Ceci minimise la reconnaissance immunitaire innée de l’ARNm transcrit in vitro. Grâce à notre protocole facile à réaliser, les taux de transfection se siant entre 50 et 65 % (macrophages péritonéaux (PM)) et 85 % (BMDM) sont atteints alors que, ce qui est important, il n’y a pas de cytotoxicité ou d’immunogénicité observée. Nous décrivons en détail (i) comment l’ARNm immunologiquement réduit au silence pour la transfection peut être généré à partir de constructions d’ADN telles que les plasmides et (ii) la procédure de transfection elle-même.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous présentons un protocole pour la transfection très efficace des macrophages primaires habituellement difficiles-à-transfect avec l’ARNm transcrit in vitro. Fait important, la transfection des macrophages utilisant ce protocole n’induit pas la mort cellulaire ou n’active pas la signalisation proinflammatoire indiquant que ni le réactif transfection ni l’ARNm transfecté ne sont reconnus comme non-auto.
La qualité de l’ARNm est d’une importance capitale pour la transfection réussie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).
Materials
| 5-methyl-CTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1138S | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase | New England BioLabs | M0289 | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) | New England BioLabs | B0289 | stored at -20 °C |
| anti-NEMO/IKKγ antibody | Invitrogen | MA1-41046 | stored at -20 °C |
| anti-β-actin antibody | Sigma-Aldrich | A2228 | stored at -20 °C |
| Petri dishes 92,16 mm with cams | Sarstedt | 821,473 | stored at RT |
| CD11b Microbeads mouse and human | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | stored at 4 °C |
| Cre recombinase + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C |
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| Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C |
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| DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | stored at RT |
| eGFP + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C |
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| eGFP + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C |
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| Fast Digest buffer (10X) | Thermo Scientific | B64 | stored at -20 °C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | stored at -20 °C |
| high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | stored at -20 °C |
| IKKβ + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C |
|
| IKKβ + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C | |
| in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) | New England BioLabs | E2060 | stored at -20 °C |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | stored at RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | stored at RT |
| mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | stored at 4 °C |
| Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid | Addgene | 11105 | stored at -20 °C |
| Mutant NEMOC54/347A plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
| pEGFP-N3 plasmid | Addgene | 62043 | stored at -20 °C |
| poly(I:C) | Calbiochem | 528906 | stored at -20 °C |
| pPGK-Cre plasmid | F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C | ||
| pseudo-UTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1139S | stored at -20 °C |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | stored at RT |
| Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated | BioLegend | 101212 | stored at 4 °C |
| Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated | eBioscience | 12-4801-82 | stored at 4 °C |
| recombinant M-CSF | Peprotech | 315-02 | stored at -20 °C |
| RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | stored at 4 °C |
| RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | stored at RT |
| ultrapure LPS from E.coli O111:B4 | Invivogen | stored at -20 °C | |
| Wild type IKKβ plasmid | Addgene | 11103 | stored at -20 °C |
| Wild type NEMO plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
References
- Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
- Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
- Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
- Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
- Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
- Hornung, V., et al. 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
- Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
- Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
- Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).
