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Genetics

急性骨髄性白血病細胞におけるCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質によるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割の調査

Published: September 01, 2019
doi:
10.3791/60130
, , , ,
1Blood Cancer Cytogenetics and Genomics Laboratory, Department of Anatomical and Cellular Pathology, Prince of Wales Hospital,The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory in Oncology in South China,The Chinese University of Hong Kong

Summary

組み立て済みのCas9/ガイドRNAリボヌクレオタンパク質複合体の直接送達は、血行細胞におけるゲノム編集のための迅速かつ効率的な手段である。ここでは、このアプローチを用いてRUNX1イントロニックサイレンサーを削除し、OCI-AML3白血病細胞における転写応答を調べる。

Abstract

ヒトゲノムの大部分(約98%)は、コーディング以外のシーケンスで構成されます。Cis-調節要素(CRA)は、遺伝子発現を調節する転写調節部位の結合部位を含む非コードDNA配列である。CRAの改変は、がんを含む様々な疾患に関与している。プロモーターとエンハンサーは遺伝子調節を研究するための主要なCREでしたが、遺伝子抑圧を媒実する別のタイプのCREであるサイレンサーの役割についてはほとんど知られていません。もともと原核生物の適応免疫システムとして同定されたCRISPR/Cas9は、真核生物ゲノム編集のための強力なツールとして利用されています。ここでは、ヒトRUNX1遺伝子のイントロニックサイレンサーを削除し、OCI-AML3白血病細胞における遺伝子発現への影響を調べる手法を紹介する。我々のアプローチは、2つの組み立て済みのCas9/ガイドRNA(gRNA)リボヌクレオタンパク質(RNP)複合体のエレクトロポレーション媒介配信に依存し、サイレンサーを横切る2本の二本鎖破断(DSB)を作成します。フラグメント分析により、削除を容易にスクリーニングできます。代替プロモーターから転写された異なるmRNAの発現分析は、プロモーター依存性効果の評価に役立つ。この戦略は、他のCROを研究するために使用することができ、特にプラスミドベースの方法でトランスフェクトすることが困難である血統細胞に適しています。プラスミドおよびウイルスフリー戦略の使用は遺伝子調節機能の簡単で、速い査定を可能にする。

Introduction

Cis-調節要素(CREs)は、遺伝子発現1、2を制御する転写調節部位の結合部位を含む非コード化DNA配列である。これらの要素は、通常、100 ~ 1,000 の基本ペア (bp) の長さです。プロモーターとエンハンサーは、2 つの最も特徴的なタイプの CRO です。プロモーターは転写開始部位の近くに存在し、転写の基本単位を構成する。多くの遺伝子は複数のプロモーターを持っており、その代替使用は転写物多様性および組織特異性3、4に寄与する。一方、エンハンサーは転写を活性化し、上流、下流、または標的遺伝子のイントロン内に配置することができます。エンハンサーは遠くから(メガベースを越えて)、向き1、2に依存しない行動をすることができます。CREsには、サイレンサーと絶縁体5、6も含まれています。前者は、転写リプレッサーに結合することによって遺伝子発現を阻害するエンハンサーとは反対に作用し、後者はゲノムを離散的トポロジ的ドメインに分割して、他のCROから他のCROから遺伝子を絶縁する。これらの要素は、短距離および/または長距離クロマチン相互作用を介して互いに協調して作用し、適切な時空間的遺伝子発現を指示するために調節ハブに編成される。ハイスループットシーケンシング技術の最近の進歩は、系統特異的遺伝子を決定する転写ネットワークの理解を大幅に促進した多くのCROの同定と機能的アニュテーションを加速しました。異なる細胞および組織タイプ7、8、9、10、11、12における発現。

転写を調節する上でのCROの基本的な役割を考えると、その変化は異常な遺伝子発現につながる可能性がある。CRAは、異なるタイプのヒト癌における遺伝的およびエピジェネティックな変化によって頻繁に破壊され、それによって腫瘍の開始、進行および攻撃性13、14に寄与することが示されている。さらに、CRE結合因子は、多くの場合、様々な癌タイプで変異および/または誤発現され、さらに腫瘍形成15におけるCRE自由化の重要性を強調する。CREsはまた、B細胞リンパ腫16における隣接する腫瘍遺伝子の異常な活性化をもたらす免疫グロブリン重(IgH)遺伝子エンハンサーの頻繁な染色体再配列によって例示されるように、構造的収差の影響を受けることができる。急性骨髄性白血病(AML)では、染色体3q再配置による単一エンハンサーの再配置は、加重GATA2ダウンレギュレーションおよびEVI1活性化を引き起こし、BETのエンハンサー機能の阻害によって標的化される可能性がある。17.最近、小児患者18におけるAML進行に寄与する可能性のあるRUNX1イントロニックサイレンサーの摂動を伴う新規染色体転移を特徴付けた。したがって、非コード癌ゲノムを解読することは、疾患病因、バイオマーカーの発見および治療介入を解明するための実りある道を提供し、最終的に患者の転帰を改善する。

CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ経路は、もともと原核細胞の適応免疫系として同定され、生細胞および生物における部位特異的ゲノム編集のための迅速かつ費用対効果の高い手段として利用されてきた19,20 、21、22。CRISPR/Cas9システムには、gRNAと連鎖球菌の2つの主要成分が含まれます:GRNAと連鎖球菌由来のCas9ヌクレアーゼ。gRNAには、ターゲット領域を認識し、Cas9に編集を指示するプロトスペーサーと呼ばれる特定の配列が含まれています。gRNAは、CRISPR RNA(crRNA)、典型的には標的DNAを相補する20merヌクレオチド配列、およびヌクレアーゼの結合足場として機能するトランス活性化crRNA(tracrRNA)の2つの部分で構成される。標的部位に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)(5′-NGG)はCas9切断に必要であり、切断部位はPAMの上流に3ヌクレオチドに位置している。Cas9とクローンgRNA23をコードするプラスミドを使用します。しかし、このアプローチは、多くの場合、トランスフェクトが困難であり、長いウイルスベースの誘導方法を必要とする血化細胞にとって困難です。別のアプローチは、組み立て済みのCas9/gRNA RNP複合体24の直接細胞送達である。RNP送達のための一般的な方法は、細胞膜内に一時的な細孔を生成するエレクトロポレーションであり、したがって、細胞25、26へのRNP複合体の侵入を可能にする。このアプローチの利点は、使いやすさ、減少したオフターゲット効果およびRNP複合体の安定性を含む。ここでは、AML患者の末梢血から確立されたOCI-AML3白血病細胞株18におけるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割を調べるためにRNP送達法を用いたプロトコルについて説明する。フランス系アメリカ人-イギリスのM4サブタイプ27と診断された。プロトコルは、crRNAの設計、RNP複合体の調製、エレクトロポレーション、ならびに所望のクローンのスクリーニングおよびその後の特性化を含む。

Protocol

1. crRNAの設計 Web ベースの CRISPR設計ツール28、29、30、31 を使用して、ターゲット CRE の2つの CRRNA、1 つの 5′ と他の 3′ を設計します。NGG の PAM が Cas9 認識のターゲット シーケンスの直下流にあることを確認します。RUNX1サイレンサー18の削除に関する2つのcrRNA(crRNA-1およびcrRNA-2)の設計を図1に示す。注:crRNAは、通常、標的配列を補完する20merプロトスペーサーを含む。 オンラインゲノムブラウザ(例えば、NCBI 1000ゲノムまたはUCSCゲノムブラウザ)の検索ボックスに配列のゲノム位置を入力することにより、標的および隣接するPAM配列における単一ヌクレオチド多型(SNP)/インデルの存在を確認する。注:一般的なNGP/インデルは、一般集団で少なくとも1%のマイナー対立遺伝子周波数を持っています。 選択した crRNA シーケンスを送信して、商用ベンダーと合成します。また、gRNA二重形成のためのtracrRNAを購入する。 2. 削除スクリーニングプライマーの設計 意図した削除領域を横切るプライマーのペアを設計します。プライマーがCas9切断部位から少なくとも50bpであることを確認し、PCR増幅が切断部位で形成されたインデルの影響を最小限に抑えるようにします。 アンプリコンが1,200 bpより小さいことを確認します(好ましくは600 bpより小さいので、より良いサイズ分解能を持っています)。また、蛍光色素(例えば、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM))を有するプライマーの1つに標識を5’エンドで標識し、検出する。RUNX1サイレンサー削除18のスクリーニングに使用されるプライマーを図1に示します。 3. Cas9/gRNA RNP複合体の調製 1x TE バッファー(10 mM トリス、0.1 mM EDTA、pH 7.5)で crRNA および tracrRNA を 200 μM の最終濃度に再中断します。 crRNAごとに、200 μM crRNA の 2.2 μL、200 μM tracrRNA の 2.2 μL、1x TE バッファーの 5.6 μL を 0.2 mL チューブに混合し、44 μM の最終二重鎖濃度を得ます。 サーモサイクラーで5分間95°Cでインキュベートします。gRNA複合体形成のためにチューブを室温まで冷却します。 62 μM 組換えCas9ヌクレアーゼの10.4 μLを1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)の7.6μLで希釈し、36μMの最終的なヌクレアーゼ濃度を得た。注:この量は、2つのCas9/gRNA複合体の調製に十分である。 希釈されたヌクレアーゼの等しい体積(8.5 μL)を、ステップ3.3から得られたgRNAデュプレックスのそれぞれと混合します。 RNP複合体形成を可能にするために、室温で20分間インキュベートします。エレクトロポレーションまで氷の上に混合物を保管してください。 4. RNP複合体のOCI-AML3細胞へのエレクトロポレーション RPMI 1640培地における培養OCI-AML3細胞は、10%熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)、1xグルタマックス、ペニシリンの100単位/mLおよびストレプトマイシンの100μg/mL(以下、完全なRPMI 1640培地と呼ばれる)で37°Cで5%を補充した。 トリパンブルー染色を使用して細胞をカウントします。エレクトロポレーション時の細胞生存率が90%を超えるようにしてください。 室温で5分間500 x gの1.5 mLチューブ内の遠心分離機2.5 x 106セル。上清を取り出し、1x PBSの1mLで細胞を洗浄します。再び細胞をスピンダウンし、すべての残留上清を除去します。 フェノール赤色を使用せずにRPMI 1640培地の163μLで細胞を再中断する。 各RNP複合体の16.7 μL(ステップ3.6から)と100 μMエレクトロポレーションエンハンサーの3.6 μLを細胞に加えます(総体積= 200 μL)。ピペッティングで優しく混ぜます。注:エレクトロポレーションエンハンサーは、編集効率を高めるためのキャリアDNAです。 気泡なしで0.2 cmギャップのエレクトロポレーションキュベットに混合物を移します。エレクトロポレーションシステムでエレクトロポレーションを実行します(モード:指数;電圧=150V;容量 = 700 μF;抵抗 = 50 Ω)。 完全なRPMI 1640培地の6 mLを含むT-25組織培養フラスコに細胞を移し、5%CO2で37°Cでインキュベートする。 5. ビアレリック欠損を伴う細胞クローンのスクリーニングと選択 エレクトロポレーションの1日後に完全なRPMI 1640培地で5 x 103/mLに細胞を希釈する。希釈した細胞懸濁液の100 μLを96ウェル組織培養プレートの各ウェルに加え、細胞が7〜14日間増殖できるようにします。 ハイスループット精製システムを用いて細胞からゲノムDNAを抽出する。 96ウェル抽出プレートの各ウェルに100 μLのプレート結合およびリシスバッファーを追加します。1x PBSの10 μLで再懸濁した5 x 104セルをバッファーに追加し、ピペッティングによってそれらを混合します。 室温で30分間インキュベートし、ゲノムDNAを井戸に結合できるようにします。 井戸の表面を削ることなく、井戸から溶液を吸引します。120 μL の洗浄バッファーで井戸を洗浄します。 結合したDNAを含む井戸を空気乾燥させます。 PCRミックスの20 μL(10倍高忠実度バッファーの2μL、50mM MgSO4の0.8 μL、10mM dNTPの0.4 μL、10μM FAM標識フォワードプライマーの0.4 μL(ステップ2.2)、10μM無標識リバースプライマーの0.4 μL、各ポリマーの0.4 μLを調製します。注:マスターミックスを準備して、各サンプルに標準化された量の試薬を確実に添加します。 抽出プレートの各ウェルにPCRミックスを追加し、サーモサイクラーで反応を実行します(条件:初期94°Cを2分間、続いて15sで94°C、30sで56°C、1分間68°C)。 フッ素計を用いて選択した数のサンプルの濃度を測定して、製品の量を推定します。ヌクレアーゼフリーH2 Oですべてのサンプルを0.5 ng/μLに希釈します。 希釈されたPCR製品の1 μLを、遺伝分析装置と互換性のある96ウェルプレートに8.5μLの脱イオン化ホルマミドと0.5μLの蛍光色素標識サイズ標準を混ぜます。注:脱イオン化されたホルマミドとサイズ標準を含むマスターミックスを準備します。 プレートセプタでプレートを覆い、サーモサイクラーで3分間95°Cでサンプルを変性させます。機械のふたを閉じないようにしてください。 前述の32のように標識されたPCR製品を分離するために毛細血管ゲル電気泳動を行う。 電気泳動の後、分析ソフトウェアを開いて結果を分析します。 [新しいプロジェクト]をクリックし、[マイクロサテライト]を選択します。次に、[OK]をクリックします。 [サンプルをプロジェクトに追加]をクリックし、結果ファイルを選択します (.fsa 拡張子を含みます)。次に、[リストに追加]をクリックしてファイルをインポートします。 選択した結果ファイルを示す表で、[分析方法]列で[マイクロサテライトの既定値] を選択します。また、[サイズ標準] 列で使用するサイズ標準を選択します。次に、[分析]アイコンをクリックし、実験名を入力して実験を保存します。 [プロットの表示]をクリックして結果を表示し、[プロット]設定でフラグメント解析を選択します。 解析に適した色付きのチャネルを選択します。オレンジ色のアイコンをチェックして、サイズ標準のラベル付きフラグフラグを表示して、サイズ呼び出しの品質を評価します。 青いアイコンを確認して、ラベル付きの PCR 製品を表示します。野生型および変異型(すなわち、予想される欠損を有する)製品に対応するピークを特定します。各サンプルの変異レベルを推定し、変異ピークの下の領域を野生型ピークと変異型ピークの下の面積の合計で割ることによって推定します。 さらにシリアル希釈を行う場合は、予想される削除レベルが高い複数のセル プールを選択します。 DNA抽出、蛍光PCRおよび毛細血管電気泳動ステップを繰り返す。変異レベル >95% 後続の解析でビアレリック欠損を表すセル クローンを選択します。 Sanger シーケンスによって、選択したクローン内の削除の ID を確認します。 6. リアルタイム定量RT-PCR分析によるサイレンサー欠失の機能解析 選択したクローンから総RNAを抽出し、相補的なDNA(cDNA)合成を行います。 RNAの1 μGを50 μMオリゴ(dT)20プライマーと10 mM dNTPミックスの1μLと混合し、10 μLの総体積で10 μLのインキュベートを65°Cで5分間インキュベートし、少なくとも1分間氷の上に置きます。 10x RTバッファーの2μLを含むcDNA合成ミックスの10 μL、25 mM MgCl2の4μL、0.1M DTTの2μL、RNase阻害剤の1μL(40U/μL)、および1 μLの逆転写酵素(200U/μL)を添加します。50°Cで50°C、サーモサイクラーで5分間85°Cでインキュベートします。注:リバースクリ起のマスターミックスを準備します。 サンプルを氷で冷やします。RNase Hの1 μLを追加し、37 °Cで20分間インキュベートし、cDNAを-20°Cで保存します。 代替プロモーターから生成された個々の転写変異体を特に認識するプライマーおよびTaqManプローブを設計します。注:あらかじめ設計されたトランスクリプト固有のプライマー/プローブセットが市販されています。 特異的転写配列を含むDNA断片をプラスミドDNAにクローンする。組換えプラスミドの10倍希釈シリーズ(10~10部)を転写物定量の標準曲線として準備します。 各サンプル(cDNAおよびプラスミド規格の両方)に対して、20 μLのPCRミックス(DNAテンプレートの0.5μL、20倍の事前設計されたTaqManプローブ/プライマーアッセイの1μL、2x TaqMan PCRマスターミックスの10μL)を調製します。各サンプルを三つなで測定します。注:リアルタイム PCR のマスター ミックスを準備します。 リアルタイムPCRマシンで反応を実行します(条件:初期50°Cを2分間、95°Cを10分間、続いて15sで94°C、1分間60°Cの40サイクルを行います)。 増幅後、ソフトウェアの[分析]アイコンをクリックしてデータを分析します。標準曲線の傾きと相関係数を確認して、反応の効率と直線性を評価します。勾配が -3.1 ~ -3.6 の間にあり、相関係数が 0.99 より大きいことを確認します。 ハウスキーピング遺伝子を持つ各サンプルの標的転写物のコピー数を正規化する(例えば、GAPDH)。

Representative Results

この実験の目的は、RUNX1遺伝子のイントロニックサイレンサーを削除し、OCI-AML3細胞におけるRUNX1転写への影響を調べることである。サイレンサーは組み合わせ分子アプローチによって同定され、209bpコア要素18を含むことがわかった。RUNX1発現を制御する上で、このコア要素をより正確に評価できるように、crRNA(crRNA-1およびcrRNA-2)は、この領域18(図1)に密接に標的を向けるように設計された。crRNA-1およびcrRNA-2によってもたらされる予測Cas9切断部位は、それぞれコア素子から29bpおよび35bpであった(図1)。なお、2つのcrRNAのPAMサイトは反対側のストランド上に存在しますが、DSBはPAMシーケンスの位置とは独立して発生します。したがって、crRNA-1およびcrRNA-2によって導かれた2つのCas9/gRNA RNP複合体の併用導入は、RUNX1遺伝子座からサイレンサー要素を切除することが期待される。 多数のサンプルで所望の欠損をスクリーニングするために、高スループット精製に96ウェル形式のゲノムDNA抽出キットを使用した。また、抽出プレートの井戸に結合したDNAは直接増幅を受けることができるため、サンプル移動の繰り返しによる誤差や汚染を最小限に抑えることができます。欠損18のスクリーニングに使用されるプライマーを図1に示す。野生型PCR製品の期待サイズは約500bpです。意図された削除は 273 bp に及ぶため、変異体産物は約 230 bp になると予想されます。このサイズ範囲は毛細血管ゲル電気泳動による簡単で、急速な断片分析を可能にする。合計160個の初期細胞プールがスクリーニングされ、14個が少なくとも70%の変異レベルで予想される欠損を運ぶことが判明した。その後、5つのプールが選択され、さらに連続希釈が行われ、バイアレリック欠損を有するクローンを特定しました。異なるレベルの変異体産物を持つ細胞クローンからの代表的な電気フェログラムを図2Aに示す。削除の ID は、サンガー シーケンスによって検証されました (図2B)。予想通り、DSB33の非相同末端接合修復によって形成されたインデルは、欠失クローン中の予測切断部位で観察された。その結果、様々なサイズの変異体産物が増幅され、毛細血管電気泳動によって検出される可能性がある(図2A)。 RUNX1遺伝子は、2つのプロモーターすなわち遠位P1および近位P2を含み、これはサイレンサー要素34を収容する大きなイントロンによって分離される。3 つの主要な mRNA 転写物は、これらのプロモーターによって生成されます: P1 によるRUNX1cとRUNX1aとRunX1b by P234.RUNX1cおよびRUNX1bのヌクレオチド配列は、前者が固有のN終位を有する以外は同一であり、そこから特定のTaqMan遺伝子発現アッセイを設計することができる(図3A)。RUNX1bを測定するには、RUNX1b とRUNX1cの両方を認識する TaqMan アッセイが使用されました (図 3A)。次に、RUNX1bレベルは、RUNX1c から合計RUNX1b/RUNX1cを減算することによって決定されました。RUNX1aは、代替スプライシングによる明らかに短いアイソフォームであり、特定のTaqManアッセイがこのバリアントで利用可能です(図3A)。したがって、P1およびP2プロモーターの活性は個別に決定することができる。リアルタイム定量RT-PCRは、サイレンサー要素の欠失がP1およびP2由来の転写物の発現レベルを有意にアップレギュレートすることを示した(図3B)。 図 1: RUNX1イントロニックサイレンサーを削除する戦略。サイレンサー(赤い箱)は、2つのプロモーターP1とP2を分離するRUNX1遺伝子の第1のイントロンに位置する(hg19座標が示されている)。2つのcrRNA(crRNA-1およびcrRNA-2)は、サイレンサー要素に隣接するDSBを導入するように設計された。予測されたCas9切断部位は垂直赤線で示され、PAM部位(NGG)は紫色です。欠損のスクリーニングに使用される2つのプライマーは、開いている矢印で表されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 2: 削除クローンの識別。(A) 変異型PCR産物(MUT)の異なるレベルを示す細胞クローンの代表的な電気フェログラム。変異体産物の大きさは、切断部位に形成されたインデルのためにクローン間で異なる。WT = ワイルドタイプ。(B) サンガーシーケンシングによる代表クローンからの削除の検証この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 3: サイレンサーの削除による機能的な結果。(A) 3 つの主要な RUNX1 アイソフォーム (RUNX1a、RUNX1b、RUNX1c) が表示されます。これらの変異体は、同じRunt DNA結合ドメインを含むが、異なるN-(オレンジ)またはC-終産(青色)を含む。TaqMan プローブ/プライマーペアの位置は赤い線で示されます。数値はアミノ酸残渣を示す。(B) (DEL) または (WT) ビアレル欠損を持つ細胞集団におけるRUNX1 P1-およびP2由来転写物のリアルタイム定量RT-PCR分析18. GAPDHは正規化に使用されました。* および ** は、マン・ホイットニー検定によってそれぞれP < 0.05 およびP < 0.01 を示します。この図は、Cheng et al.18から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

CRISPR/Cas9システムは、遺伝子ノックアウトやノックイン研究35、36、転写調節37、38、様々な遺伝子工学などのゲノム編集アプリケーションの広い範囲で使用されていますモデル生物39、40、41、42、43、44および遺伝子治療45、46。ここでは、CRISPR/Cas9を用いてRUNX1遺伝子上のイントロニックサイレンサーを削除した場合の機能的影響を調べた。我々のアプローチにおけるCRISPR成分の送達は、プラスミドDNA、gRNAまたはウイルスのクローニングではなく、組み立てられたCas9/gRNA RNP複合体のエレクトロポレーションに依存しなかった。外因性DNAの使用は、宿主ゲノムへの外来ベクター配列の望ましくない統合と関連し、毒性の増加と低効率25、47、48、一方で示されている。ウイルスの誘導方法は時間がかかります。さらに、プラスミドDNAからのCas9の長期発現は、オフターゲット効果48を増強することができる。それどころか、編集効率、選択性、細胞生存率が向上し、高速かつ簡単に行えるため、RNPベースの直接送達アプローチが推奨される方法として確立されています。確かに、リポフェクション49、50、エレクトロポレーション25、51、ナノ粒子52、細胞貫通ペプチド53、iTOP54およびTRIAMFなどの様々な方法55は多様な細胞タイプだけでなく、動物および植物種への効率的なCRISPR/Cas9送達のために開発された24、25、26、56、57,58歳,59歳,60歳,61歳,62の,63. 非コードDNA配列は遺伝的変異のホットスポットであるので、標的および隣接するPAM配列における一般的なSGP/インデルの存在をチェックすることは、規制を対象とするgRNAを設計する際に特に関連する。要素。

CRISPR/Cas9ゲノム編集のボトルネックは、多数のサンプルで所望の変異クローンをスクリーニングすることです。標的変異は約300bpの小さなゲノム欠失であるとして、スクリーニングのために毛細血管ゲル電気泳動と結合した蛍光PCRを採用した。この方法は、迅速かつ敏感であり、ハイスループットの方法で実行することができます。また、この方法は、変異レベルと削除サイズを同時に正確に推定することができます。さらに、異なる蛍光色素で標識されたPCR断片の多重分析が支持される。私たちは、骨髄新生物65、66の小さな挿入/欠損を遺伝子型化するために、この技術を日常的に使用してきました。私たちの経験では、高精度で変異負荷が~3%まで下がり、4bp異なる断片サイズを一貫して検出することができます。ただし、この方法はフラグメントサイズの制限が 1,200 bp であるため、大規模な欠損のスクリーニングには適しないことに注意してください。また、ベース置換(結果としてフラグメントサイズが変更されない)および他のゲノム領域における潜在的なオフターゲットイベントは検出できません。後者の場合、ターゲットクローンにおけるグローバルな望ましくない変化を包括的にプロファイリングするには、高価な全ゲノムシーケンシングが必要です。大規模な非コーディング規制配列(>1,000 bp)の調査のための現在のアプローチを採用するために、インビトロレポーター遺伝子アッセイを用いた置き起こし転写因子結合部位の詳細な欠失および変異解析を行うことができる。CRISPR/Cas9編集18の最小機能領域を事前に記述する。

多くの遺伝子は複数のプロモーター3、4を含むので、調節要素を操作することは、プロモーターに差異的に影響を与える可能性があるため、標的遺伝子遺伝子座における代替プロモーターの存在を認識することが重要である。したがって、異なるプロモーターから派生した転写変異体は、任意のプロモーター特異的応答を評価するために個別に測定する必要があります。TaqManプローブベースのアッセイの使用は、より良い特異性と再現性のためにSYBRグリーンよりも好ましいです。より高度なデジタルPCRシステムが利用可能な場合、転写物定量は標準的なカーブ構造を必要とせずにより正確に行うことができる。

がん細胞株でCRISPR/Cas9実験を行う上で重要な考慮事項は、構造およびコピー数の変動を含む遺伝的変化を含む事実上すべての癌細胞株として使用される細胞におけるプロイディおよび標的遺伝子コピー数である。我々の場合、OCI-AML3は45~50染色体を有する高脂質核葉型を有する。また、細胞株は、がん細胞株百科事典67および蛍光から明らかになった通常のRUNX1コピー番号を持つことがわかった18.コピー数ゲインを持つ遺伝子を標的とする場合、編集に十分なレベルのCRISPRコンポーネントを提供するために、送達方法を最適化する必要がある場合があります。また、完全なノックアウトを識別するために、より多くのクローンをスクリーニングする必要がある場合もあります。重要なことに、増幅されたゲノム領域、特に構造的な再配列によって引き起こされるものを標的にすると、癌細胞における遺伝子独立性抗増殖応答を引き起こし、遺伝子に偽陽性の結果をもたらすことが示されている。機能学68,69,70.この点に関して、RNA干渉(RNAi)ノックダウンやcDNA過剰発現などの代替アプローチを採用して、CRISPR所見を検証する必要があります。また、複数の細胞株を使用して、細胞株特異的であるが遺伝子に依存しないCRISPR編集効果の誤解を避ける必要があります。

CRISPR/Cas9システムは、ゲノム編集にシンプルで効率的な手段を提供することで、基礎研究と翻訳研究に革命を起こしました。ここでは、CRISPR/Cas9を使用して、がん細胞株の転写研究のためのイントロニックサイレンサーを破壊する容易さを示します。この技術は、DNAレベルでのCREの研究を可能にし、従来の異種レポーター遺伝子ではなく、内因性の文脈でCRE機能を調べる機会を提供します。最近では、CRISPRベースのRNA編集システムも71と同定されており、調節元から転写されたRNAを標的にしてCREを研究する新しいツールとして役立つ可能性があります。CRISPR/Cas9は、染色体立体構造捕捉技術と組み合わせることで、様々な健康問題に関連する遺伝子の組織化や遺伝子発現におけるCREsの関与を解読するのに役立ちます。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、OCI-AML3細胞株を提供してくれたM.D.ミンデン教授(プリンセスマーガレット癌センター、大学ヘルスネットワーク、カナダ、トロント)に感謝したいと思います。また、がんゲノミクスと病理学(香港中文大学)の中核的なユーティリティに感謝したいと思います。

Materials

0.2 cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad 1652086
1×TE buffer, pH7.5 Integrated DNA Technologies 11-01-02-02
10mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific 18427013
3500 Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405673
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer Thermo Fisher Scientific None
7300 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific None
7300 System SDS Software Thermo Fisher Scientific None Version 1.3.1
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system Bio-Rad 1652660
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well Thermo Fisher Scientific CS11205
crRNA-1 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
crRNA-2 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
Deionized formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
Electroporation Enhancer Integrated DNA Technologies 1075915
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270098
Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32857
GeneMapper Software 5 Thermo Fisher Scientific 4475073
GeneScan 600 LIZ Size Standard Thermo Fisher Scientific 4408399
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
PBS, 10X Solution, pH7.4 Affymetrix 75889
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher Scientific 11304029
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease Integrated DNA Technologies 1081058 Components of the Cas9/gRNA complex
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 31800-022
RPMI 1640 medium without phenol red Thermo Fisher Scientific 11835030
RUNX1a TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs04186042_m1
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs00231079_m1
RUNX1c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs01021966_m1
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher Scientific 18080051
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4304437
tracrRNA Integrated DNA Technologies 1072533 Components of the Cas9/gRNA complex
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Unlabeled PCR reverse primer Thermo Fisher Scientific None
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Cheng, C., Wong, T. H., Yung, Y., Chan, N. C., Ng, M. H. Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (151), e60130, doi:10.3791/60130 (2019).
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