JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

חקירת התפקיד הטרנססאני של משתיק הRUNX1 נית על ידי CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein בתאי לוקמיה מיאלואיד חריפה

Published: September 01, 2019
doi:
10.3791/60130
, , , ,
1Blood Cancer Cytogenetics and Genomics Laboratory, Department of Anatomical and Cellular Pathology, Prince of Wales Hospital,The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory in Oncology in South China,The Chinese University of Hong Kong

Summary

מסירה ישירה של טרום התאספו Cas9/מדריך RNA ribonuאופאנפרוטאין מתחמי הוא אמצעי מהיר ויעיל לעריכת הגנום בתאי המטפאות. כאן, אנו מנצלים את הגישה הזאת כדי למחוק משתיק RUNX1 ביטרוניק ולבחון את התגובות הטרנדיות בתאי OCI-AML3 לוקמיה.

Abstract

החלק העיקרי של הגנום האנושי (~ 98%) מורכבת מרצפים שאינם מצפינה קידוד. רכיבי Cis-רגולטוריות (cres) הם שאינם קידוד רצפי DNA המכילים אתרי קשירה עבור הרגולטורים הטרנססקריפט כדי לווסת את הביטוי הגנטי. שינויים של CREs היו מעורבים במחלות שונות כולל סרטן. בעוד היזמים משפרי היו CREs העיקרי עבור לימוד התקנה גנים, מעט מאוד ידוע על התפקיד של משתיק קול, שהוא סוג אחר של היצור המדיטים גנים הדיכוי. זוהה במקור כמו מערכת חסינות אדפטיבית prokaryotes, crispr/Cas9 כבר ניצל להיות כלי רב עוצמה עבור הגנום איקריוטית. כאן, אנו מציגים את השימוש בטכניקה זו כדי למחוק משתיק קול ב- RUNX1 gene האנושי ולחקור את ההשפעות על הביטוי הגנטי בתאי OCI-AML3 לוקמיה. הגישה שלנו מסתמך על משלוח אלקטרופורציה-מתווך של שני התאספו Cas9/מדריך RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) מתחמי ליצור שני שבירת הגדיל כפול (DSBs) כי האגף משתיק קול. מחיקות ניתן לוקרן בקלות על ידי ניתוח קטע. ניתוח ביטויים של mRNAs השונים ששועתק מיזמים חלופיים מסייעים בהערכת אפקטים תלויי-היזם. אסטרטגיה זו ניתן להשתמש כדי ללמוד CREs אחרים והוא מתאים במיוחד עבור תאים המטבטיים, אשר לעתים קרובות קשה transfect עם שיטות מבוססות פלבאמצע. השימוש באסטרטגיה מגנטית ונטולת וירוסים מאפשר הערכות פשוטות ומהירות של פונקציות רגולטוריות של גנים.

Introduction

רכיבי ה- Cis-רגולציה (cres) הם רצפי DNA שאינם מצפינה קידוד המכילים אתרי קשירה לרגולטורים טרנססקריפט כדי לשלוט בביטוי הגנים1,2. רכיבים אלה הם בדרך כלל 100 כדי 1,000 זוגות בסיס (bp) ארוך. היזמים ומשפרי הם שני הסוגים האופיינים ביותר של CREs. היזמים נוכחים בסמיכות לאתרי התחלת התמלול ומהווים את יחידת התמלול הבסיסית. גנים רבים יש יותר מיזם אחד והשימוש האלטרנטיבי שלהם תורם הגיוון הטרנססקריפט ורקמות ספציפיות3,4. מצד שני, משפרי להפעיל תמלול יכול להיות ממוקם במעלה, במורד או בתוך introns של הגנים היעד. משפרי יכולות לפעול ממרחק רב (מעל מגאז) וללא תלות באוריינטציה1,2. Cres כוללים גם משתיקי קול ומבודד5,6. מעשים לשעבר באופן משפרי כדי לעכב את ביטוי הגנים על ידי קשירה repressors הטרנס, בעוד האחרון מחיצות את הגנום לתוך תחומים בנפרד טופולוגית כדי לבודד גנים מ CREs אחרים מתחומים שכנים. רכיבים אלה פועלים ביחד עם השני באמצעות אינטראקציות קצרות ו/או טווח ארוך של כרומטין ומאורגנות בתוך רכזות רגולטוריות כדי להפנות ביטוי גנטי מתאים באופן זמני. הפיתוחים האחרונים בטכניקות רצף התפוקה הגבוהה האיצו את זיהוי וביאור פונקציונלי של CREs רבים אשר הקלו מאוד את ההבנות שלנו של רשתות הטרנססקריפט המכתיבים שושלת היוחסין גן ספציפי ביטוי בסוגים שונים של תאים ורקמות7,8,9,10,11,12.

בהינתן התפקידים הבסיסיים של CREs בוויסות התעתיק, השינויים שלהם יכולים להוביל לביטוי גנטי מסוים. הוכח כי cres מופרת לעתים קרובות על ידי שינויים גנטיים ואפיגנטיים בסוגים שונים של סרטן האדם, ובכך לתרום חניכה הגידול, התקדמות ותוקפנות13,14. בנוסף, גורמי הקשירה מוטציה לעתים קרובות ו/או לוחצים בסוגים שונים של סרטן, הדגשת עוד יותר את המשמעות של רגולציה היצור באונבגנזה15. CREs יכול גם להיות מושפע סטיות מבנית, כפי שניתן למשל על ידי הסדרים תכופים מחדש של כרומוזום החיסוני כבדים (הגבוה) משפר גנים כי התוצאה הפעלה חריגה של אונגנים השכנה ב-cell לימפומה16. ב לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML), מיקום מחדש של משפר אחד על ידי כרומוזום 3q הסדרים מחודשת גורם במקביל GATA2 downregulation ו EVI1 הפעלה, אשר יכול להיות ממוקד על ידי ההימור בעיכוב של פונקציות שיפור 17. לאחרונה, אפיינו את הטרנסלוקציה כרומוזומלית מעורבים בRUNX1 משתיק קול שעשוי לתרום להתקדמות AML בחולה ילדיםבן 18. Thus, פענוח הגנום שאינו קידוד מספק שדרות פורה לגילוי המחלה בפתוגנזה מחלה, תגלית ביואריקר והתערבויות טיפוליות, אשר בסופו של דבר לשפר את תוצאות המטופל.

מסלול crispr/Cas9 נוקלאז, מזוהה במקור כמערכת חיסונית אדפטיבית בתאי prokaryotic, נוצל כאמצעי מהיר וחסכוני עבור האתר ספציפי לעריכה גנומית בתאי החיים ואורגניזמים19,20 ,21,22. מערכת CRISPR/Cas9 כוללת שני מרכיבים עיקריים: gRNA ו סטרפטוקוקוס pyogenesנגזר Cas9 nuclease. ה-gRNA מכיל רצף ספציפי הנקרא פרוטוספייס המזהה את אזור היעד ומפנה Cas9 לעריכה. GRNA מורכב משני חלקים: CRISPR RNA (crRNA), בדרך כלל רצף הנוקלאוטיד 20-mer משלימה את ה-DNA היעד, ו crRNA הפעלה טרנס (tracrRNA), אשר משמש הגרדום קשירה עבור nuclease. המוטיב הסמוך מוטיב (פאם) (5 ‘-NGG) בסמוך לאתר היעד נדרש עבור המחשוף Cas9 ואת אתר המחשוף ממוקם 3 נוקלאוטידים במעלה הזרם של פאם. CRISPR/Cas9-תיווך העריכה באופן שכיח על ידי בתאי החוצה עם באמצע הפלזמה המקודד Cas9 והוא משוכפל gRNA23. עם זאת, גישה זו מאתגרת עבור תאים המטבטיים, אשר לעתים קרובות קשה transfect ודורשים שיטות ממושך המבוססת על וירוסים. גישה חלופית היא משלוח סלולרי ישיר של טרום התאספו Cas9/gRNA RNP מתחמי24. שיטה נפוצה עבור משלוח rnp היא אלקטרופורציה, אשר מייצרת נקבוביות זמניות בקרום התא, ובכך מאפשר כניסה של מכלולי rnp לתוך התאים25,26. היתרונות של גישה זו כוללים קלות שימוש, הפחתת היעד של ההשפעות והיציבות של מכלולי RNP. כאן, אנו מתארים פרוטוקול של שימוש בשיטת משלוח RNP כדי לחקור את התפקיד הטרנסקריפטלי של משתיק RUNX1 אינטרוניק ב-OCI-AML3 לוקמיה קו התאים18, אשר הוקמה מן הדם ההיקפי של מטופל AML שאובחנו עם הסוג הצרפתי-אמריקאי-בריטי של M427. הפרוטוקול כולל את העיצוב של crRNA, הכנת מכלולי RNP, אלקטרופורציה, כמו גם הקרנה והאפיון הבאים של המשובטים הרצוי.

Protocol

1. עיצוב של crRNA עיצוב שני crrnas, אחד 5 ‘ ו 3 השני ‘ של היצור היעד באמצעות אינטרנט מבוסס מכשיר העיצוב כדור28,29,30,31. ודא כי פאם של NGG ממוקם מיד במורד הזרם של רצף היעד עבור זיהוי Cas9. העיצוב של שני crRNAs (crRNA-1 ו-crRNA-2) למחיקה של RUNX1 משתיק18 מוצג באיור 1.הערה: CrRNA בדרך כלל מכיל 20-מר פרוטומרווח כי הוא משלים את רצף היעד. בדוק את הנוכחות של נוקלאוטיד בודד פולימורית (SNPs)/inדלים ב היעד ואת רצפי פאם הסמוך על ידי הזנת מיקומים גנומית של רצפים לתוך תיבת החיפוש של דפדפן הגנום המקוון (למשל, NCBI ג 1000 Genomes או מדפדפן הגנום UCSC).הערה: Snps נפוצים/indels יש תדירות אלל קטין של לפחות 1% באוכלוסיה הכללית. שלח את רצפי crRNA שנבחרו לסינתזה עם ספק מסחרי. כמו כן, לרכוש את tracrRNA עבור היווצרות דופלקס gRNA. 2. עיצוב מחיקה התחל הקרנת תכנון זוג צבעי יסוד האגף את אזור המחיקה המיועד. ודא כי התחל הם לפחות 50 bp מאתרי המחשוף Cas9 כך הגברה ה-PCR מושפע מינימלית על ידי indels שנוצרו באתרי המחשוף. ודא אמפליקון הוא קטן יותר 1,200 bp (רצוי קטן יותר מאשר 600 bp עבור רזולוציית גודל טוב יותר). כמו כן, סמן את אחד התחל עם צבע פלורסנט (למשל, 6-carboxyfluorescein (6-משפחה)) ב 5 ‘-end עבור איתור. הצבעי היסוד ששימשו להקרנה מחיקת משתיק RUNX1 18 מוצגים באיור 1. 3. הכנת מכלולי Cas9/gRNA RNP להשעות מחדש את crRNAs ו tracrRNA ב 1 x מאגר TE (10 מ”מ טריס, 0.1 mM EDTA, pH 7.5) לריכוז הסופי של 200 μM. עבור כל crRNA, לערבב 2.2 μL של 200 μM crRNA, 2.2 μL של 200 μM tracrRNA ו-5.6 μL של מאגר 1x TE (סה כ 10 μL) בתוך שפופרת בגודל של 0.2 mL כדי לקבל ריכוז דופלקס סופי של 44 μM. מודקון ב 95 ° c עבור 5 דקות בתוך הציקלייט. אפשר לצינורות להתקרר לטמפרטורת החדר עבור היווצרות מורכבות gRNA. לדלל 10.4 μl של 62 μm רקומביננטי Cas9 נוקלאז עם 7.6 μl של מלוחים 1x פוספט באגירה (PBS) כדי לקבל ריכוז סופי נוקלאז של 36 μm.הערה: סכום זה מספיק עבור הכנת שני מכלולי Cas9/gRNA. מערבבים כרכים שווים (8.5 μl) של נוקלאז מדולל עם כל דופלקסים grna שהתקבלו משלב 3.3. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 20 דקות כדי לאפשר היווצרות מורכבות RNP. השאר את התערובות על הקרח עד שתגיע לחשמל. 4. אלקטרופורציה של מכלולי RNP לתוך OCI-AML3 תאים תרבות OCI-AML3 תאים ב RPMI 1640 בינוני בתוספת של 10% חום בלתי מופעל העובר סרום (FBS), 1x גלוטמקס, 100 יחידות/mL של פניצילין ו 100 μg/mL של סטרפטומיצין (להלן המכונה RPMI השלם 1640 בינוני) ב 37 ° c עם 5% CO2. ספירת תאים תוך שימוש בטריבין כחול מכתים. ודא שיכולת הכדאיות של התא בזמן האלקטרופורציה היא מעל 90%. צנטריפוגה 2.5 x 106 תאים בצינור 1.5 mL ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים עם 1 מ ל של 1x PBS. לסובב את התאים שוב ולהסיר את כל שרידי supernatant. השהה מחדש את התאים ב-163 μL של RPMI 1640 בינוני ללא פנול אדום.  הוסף 16.7 μL של כל קומפלקס RNP (משלב 3.6) ו 3.6 μL של 100 μM Electroporation משפר את התאים (סה כ נפח = 200 μL). מערבבים בעדינות על ידי ליטוף.הערה: משפר האלקטרופורציה הוא דנ א מוביל לשיפור יעילות העריכה. העבר את התערובת לקובט אלקטרופורציה של 0.2 ס מ ללא בועות. בצע אלקטרופורציה עם מערכת אלקטרופורציה (מצב: מעריכי; מתח =: 150 V; קיבוליות = 700 μF; התנגדות = 50 Ω). להעביר את התאים בקבוקון תרבות T-25 רקמות המכיל 6 מ ל של RPMI 1640 בינונית להשלים ו-מודטה ב 37 ° צ’ עם 5% CO2. 5. הקרנה ובחירה של שיבוטים תא עם מחיקות Biallelic לדלל את התאים כדי 5 x 103/מ ב להשלים RPMI 1640 בינוני יום אחד לאחר electroporation. הוסף 100 μL של השעיית התא מדולל לתוך כל טוב של 96-ובכן לוחיות התרבות רקמות ולאפשר לתאים לגדול עבור 7-14 ימים. לחלץ דנ א גנומית מן התאים באמצעות מערכת טיהור של תפוקה גבוהה. הוסף 100 μL של מאגר כריכת לוחית ומאגרי הליזה לכל טוב של צלחת החילוץ 96 היטב. הוסף 5 x 104 תאים מושעה 10 μl של 1X PBS למאגר ולערבב אותם על ידי ליטוף. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות כדי לאפשר כריכה של דנ א גנומית לבארות. מנטול את התמיסה מבארות מבלי לגרד את משטחי הבאר. לשטוף את הבארות עם 120 μL של שטיפת מאגר. האוויר יבש את הבארות. המכילות את הדנ א המאוגד הכינו 20 μL של שילוב PCR (2 μL של מאגר באיכות גבוהה של 10x, 0.8 μL של 50 mM MgSO4, 0.4 μl של 10 מ”מ dNTPs, 0.4 μl של 10 ΜM משפחה מתויג קדימה (שלב 2.2), 0.4 μl של 10 μm הפוך פריימר לאחור ו-0.4 U של taq DNA פולימראז עבור כל דוגמה).הערה: להכין תערובת הורים כדי להבטיח תוספת של כמויות סטנדרטיות של ריאגנטים בכל מדגם. הוסיפו את שילוב ה-PCR לכל הבאר של לוחית החילוץ והפעל את התגובות בציקלונימטר (תנאים: ראשוני 94 ° c עבור 2 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 94 ° צ’ עבור 15 s, 56 ° c עבור 30 s ו-68 ° c עבור 1 דקות). העריכו את כמות המוצרים על ידי מדידת הריכוזים שלהם במספר נבחר של דגימות באמצעות פלואורומטר. לדלל את כל הדגימות עם nuclease-H חינם2O כדי 0.5 Ng/μl. מערבבים 1 μL של מוצרי ה-PCR המדולל עם 8.5 μL של מאותמיד של הטופסו 0.5 μL של תקן פלורסנט שכותרתו צבע בקנה מידה 96-באר תואם עם מנתח גנטי.הערה: הכן שילוב מאסטר המכיל. את הטופסהרגיל והגודל הסטנדרטי מכסים את הצלחת עם צלחת septa ואת הדגימות ב 95 ° c עבור 3 דקות בתוך התרדנית. . אל תסגור את המכסה של המכונה מבצעים אלקטרופורזה בג קפילר כדי להפריד בין מוצרי ה-PCR המסומנים כמתואר בעבר32. לאחר האלקטרופורזה, פתח את תוכנת הניתוח כדי לנתח את התוצאות. לחץ על פרוייקט חדש ובחר מיקרו- לווין. לאחר מכן לחץ על אישור. לחץ על הוסף דוגמאות לפרוייקט ובחר את קבצי התוצאות (מכילים את הסיומת. fsa). לאחר מכן לחץ על הוסף לרשימה כדי לייבא את הקבצים. בטבלה המציגה את קבצי התוצאות שנבחרו, בחר בברירת מחדל Microsatellite בעמודה שיטת ניתוח . כמו כן, בחר את תקן הגודל הנמצא בשימוש בעמודה ‘ גודל רגיל ‘. לאחר מכן , לחץ על סמל הניתוח, הזן את שם הניסוי ושמור את הניסוי. לחץ על מגרשים לתצוגה כדי להציג את התוצאות ובחר בניתוח קטע בהגדרת ההתוויה. בחר את הערוצים הצבעוניים המתאימים לניתוח. בדוק את הסמל הכתום כדי להציג את הקטעים שסומנו בתקן הגודל כדי להעריך את איכות ההתקשרות. בדוק את הסמל הכחול כדי להציג את מוצרי ה-PCR המסומנים. זהה את הפסגות המתאימות לסוג הפראי ולמוטציות (כלומר, הנושאות את מחיקות הצפויות). העריכו את רמת המוטציות בכל מדגם על-ידי חלוקת האזור מתחת לשיא המוטציות לפי סכום האזור שמתחת לפסגות הסוג הפראי והמוטציות. בחר מספר מאגרי תאים עם רמות גבוהות של המחיקות הצפויות לצורך המשך הדילול הסדרתי. חזור על הפקת הדי-אן-איי, הפלורסנט וצעדי האלקטרופורזה בנימים. בחר שיבוטים תא עם רמות מוטציה > 95% המייצגים מחיקות biallelic עבור הניתוחים הבאים. אמת את זהותו של מחיקות במשובטים שנבחרו על ידי רצף Sanger. 6. ניתוחים פונקציונליים של מחיקת משתיק קול בזמן אמת כמותי-ניתוח PCR לחלץ RNA סה כ מן המשובטים שנבחרו ולבצע משלימה DNA (cDNA) סינתזה. מערבבים 1 μg של RNA עם 1 μL של 50 μM oligo (dT)20 פריימר ו 1 μl של 10 מ”מ שילוב dntp בנפח כולל של 10 μl. דגירה ב 65 ° צ’ עבור 5 דקות ולאחר מכן מקום על הקרח עבור לפחות 1 דקות. הוסף 10 μL של שילוב סינתזה של cDNA המכיל 2 μL של מאגר 10x RT, 4 μL של 25 מ”מ MgCl2, 2 μl של 0.1 M dtt, 1 μl של מעכב RNase (40 u/μl) ו-1 μl של היפוך הטרנססקריפט (200 u/μl). מודקון ב 50 ° c עבור 50 דקות ולאחר מכן 85 ° צ’ עבור 5 דקות בתוך התרדנית.הערה: הכינו תערובת מאסטר. לתעתיק הפוך . תרגיע את הדגימות על הקרח הוסף 1 μL של RNase H ו-דגירה ב 37 ° c עבור 20 דקות. לאחסן את cDNA ב-20 ° c. עיצוב התחל ובדיקה TaqMan המכירים באופן ספציפי גרסאות תעתיק בודדות שנוצרו מיזמים חלופיים.הערה: מתוכנן מראש תעתיק-מערכות הבדיקה הספציפיות-מסחרית זמין. שיבוט שברי DNA המכיל את רצפי התעתיק הספציפיים ל-DNA פלמיד. הכינו סדרת דילול בעלת 10 מקפלים (106 עד 10 עותקים) של רקומביננטי פלמידים כעקומות סטנדרטיות לתעתיק. להכין 20 μL של שילוב PCR (0.5 μL של תבנית ה-DNA, 1 μL של 20 x מעוצב מראש TaqMan בדיקה/פריימר ו 10 μL של 2x TaqMan PCR מאסטר מיקס) עבור כל מדגם (הן cDNA ו פלמיד סטנדרטים). מדוד כל מדגם בטרילקאט.הערה: הכינו תערובת ראשית. ל-PCR בזמן אמת הפעל את התגובות ב-PCR בזמן אמת (תנאים: ראשוני 50 ° c עבור 2 דקות ו 95 ° צ’ עבור 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 94 ° c עבור 15 s ו-60 ° c עבור 1 דקות). לאחר הגברה, לחץ על הסמל ‘ נתח ‘ בתוכנה כדי לנתח את הנתונים. בדוק את השיפוע ואת מקדם המתאם של עקומות סטנדרטיות כדי להעריך את היעילות ואת יניאריות של התגובות. ודא כי המדרונות הם בין-3.1 ו-3.6 ומקדמי המתאם גדולים מ 0.99. לנרמל את מספר העותקים של התעתיקים של היעד בכל מדגם עם גן משק בית (למשל, לגנד).

Representative Results

מטרת הניסוי הזה היא למחוק משתיק קול בגנים הRUNX1 ולבחון את ההשפעות על תמלול RUNX1 בתאים OCI-AML3. משתיק קול זוהה על ידי גישה מולקולרית קומבינטורית ומצאו להכיל אלמנט הליבה bp 20918. כדי לאפשר הערכה מדויקת יותר של רכיב ליבה זה בשליטה RUNX1 Expression, crRNAs (crrna-1 ו-crrna-2) תוכננו להתמקד קרוב לאזור זה18 (איור 1). הCas9 החזוי אתרי המחשוף שהובאו על ידי crRNA-1 ו-crRNA-2 היו 29 bp ו 35 bp מאלמנט הליבה, בהתאמה (איור 1). יצוין כי בעוד האתרים פאם של שני crRNAs שוכנים על קווצות מנוגדים, DSBs תתרחש באופן עצמאי מיקום הרצף של פאם. כך, המבוא המקביל של שני Cas9/gRNA RNP מתחמי מונחה על ידי crRNA-1 ו-crRNA-2 צפוי לבלו את אלמנט משתיק קול מלוקוס RUNX1 . כדי לעבור על המסך עבור מחיקות הרצוי במספר רב של דגימות, פורמט 96-היטב של ערכת החילוץ DNA גנומית שימש לטיהור תפוקה גבוהה. כמו כן, ה-DNA כרוך על הבארות של לוחיות החילוץ יכול להיות נתון הגברה ישירה, ובכך מזעור שגיאות או זיהום עקב העברה לדוגמה חוזרת. הצבעי היסוד המשמשים להקרנת מחיקות18 מוצגים באיור 1. הגודל הצפוי של מוצר ה-PCR מסוג פראי הוא כ 500 bp. מאז המחיקה מיועד משתרע על 273 bp, המוצר מוטציה צפוי להיות כ 230 bp. טווח גודל זה מאפשר ניתוח השבר פשוט ומהיר על ידי אלקטרופורזה ג’ל קפילר. סך של 160 בריכות התאים הראשוניים הוקרן ו 14 נמצאו לבצע מחיקות צפוי עם רמות מוטציה של לפחות 70%. חמש בריכות נבחרו אז עבור מדלל סדרתי נוסף כדי לזהות שיבוטים הנושאת biallelic מחיקות. הנציג electropherograms מתוך שיבוטים תא עם רמות שונות של מוצרי מוטציה מוצגים באיור 2א. זהות המחיקות אומתה באמצעות רצפי רצף של סאנגר (איור 2ב’). כצפוי, indels שנוצרו על ידי שאינם הומוולוגיים הצטרפות התיקון של DSBs33 נצפו באתרי המחשוף החזוי במשובטים המחיקה. התוצאה היא הגברה של מוצרי מוטציה בגדלים שונים, אשר ניתן גם לזהות על ידי אלקטרופורזה קפילר (איור 2א). הגן RUNX1 מכיל שני היזמים כלומר המרוחק P2 האבותיים, אשר מופרדים על ידי אינטרון גדול מחסה את אלמנט משתיק34. שלושה התעתיקים העיקריים של mRNA מיוצרים על ידי היזמים הללו: RUNX1c על-ידי P1 ו- RUNX1a RUNX1b על-ידי P234. רצף נוקלאוטיד של RUNX1c ו RUNX1b זהים למעט לשעבר יש N-טרמינוס ייחודי, ממנו שיטת הביטוי הגן הספציפי taqman יכול להיות מעוצב (איור 3א). כדי למדוד RUNX1b, שיטת TaqMan מזהה הן RUNX1b והן RUNX1c היה בשימוש (איור 3א). רמות RUNX1b נקבע אז על ידי הפחתת סך RUNX1b/RUNX1c מ RUNX1c. RUNX1a הוא isoform קצר במובהק עקב שחבור חלופיים ושיטת TaqMan ספציפית זמינה עבור variant זה (איור 3א). כך, את הפעילות של P1 ו P2 היזמים ניתן לקבוע בנפרד. בזמן אמת כמותי RT-PCR הראה כי מחיקה של אלמנט משתיק קול באופן משמעותי את רמות הביטוי של התעתיקים של P1 ו-P2 הנגזר (איור 3ב). איור 1 : אסטרטגיה למחוק את משתיק הקול הRUNX1 נית. משתיק קול (אדום תיבה) ממוקם אינטרון הראשון של הגן RUNX1 הפרדת שני היזמים P1 ו P2 (קואורדינטות hg19 מוצגים). שני crRNAs (crRNA-1 ו-crRNA-2) נועדו להחדיר DSBs מאגף את אלמנט משתיק קול. הCas9 החזוי אתרי המחשוף מצוינים על ידי קווים אדומים אנכיים ואתרי פאם (NGG) הם בסגול. שני הצבעי היסוד המשמשים להקרנת המחיקות מיוצגים באמצעות חיצים פתוחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2 : זיהוי של המשובטים מחיקה. (א) מייצג אלקטרו pheroגרמות של שיבוטים תא מראה רמות שונות של מוטאנטים PCR מוצרים (MUT). הגודל של מוצרי מוטציה משתנה בין המשובטים בגלל indels שנוצרו באתרי המחשוף. WT = פראי. (ב) אימות מחיקות של שיבוטים מייצגים על ידי קביעת רצף של סאנגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3 : השלכות פונקציונליות של מחיקת משתיק קול. (א) שלושת RUNX1 הצורות המרכזיות (RUNX1a, RUNX1b ו-RUNX1c) מוצגות. גרסאות אלה מכילות את אותו תחום כריכת ה-DNA של גמד, אבל שונה N-(כתום) או C-טרמינוס (כחול). המיקום של זוגות בדיקה/פריימר של TaqMan מצוין על ידי קווים אדומים. מספרים מצביעים על. שאריות חומצת האמינו (ב) בזמן אמת כמותי RT-PCR ניתוח של RUNX1 P1-ו P2 נגזר התעתיקים של אוכלוסיות תאים עם (DEL) או ללא (WT) מחיקות biallelic18. שימוש בגנד לנורמליזציה. * ו * * לציין p < 0.05 ו p < 0.01, בהתאמה על ידי מבחן מאן-ויטני. דמות זו שונתה מצ ואח '18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

Crispr/Cas9 מערכת נעשה שימוש במגוון רחב של יישומים לעריכת הגנום כגון הנוקאאוט גנטי ו טוק-in מחקרים35,36, transcript תקנה37,38, הנדסה גנטית של שונים מודל אורגניזמים39,40,41,42,43,44 וטיפול גנטי45,46. כאן, אנו להדגים את השימוש CRISPR/Cas9 כדי לחקור את ההשלכות הפונקציונליות של מחיקת משתיק קול מנוטרוניק על הגן RUNX1 . המסירה של הרכיבים CRISPR בגישה שלנו לא להסתמך על ה-DNA באמצע, שיבוט של gRNA או וירוס אבל אלקטרופורציה של טרום התאספו Cas9/gRNA RNP מכלולי. זה הוכח כי השימוש ב-DNA אקסוגני יכול להיות קשור עם שילוב לא רצוי של רצפים וקטוריים זרים לתוך הגנום המארח, רעילות מוגברת ויעילות נמוכה25,47,48, בעוד שיטות התמרה וירוסים מגזול זמן רב. בנוסף, ביטוי ממושך של Cas9 מ-DNA פלמיד יכול להגדיל את ההשפעות מחוץ ליעד48. להיפך, הגישה ישיר RNP מבוסס מסירה הוקמה כשיטה המועדפת כפי שהוא מהיר וישיר עם יעילות עריכה משופרת, בסלקטיביות והכדאיות התא. אכן, מגוון של שיטות כגון ליפוף49,50, אלקטרופורציה25,51, חלקיקים52, תאים בעלי חדירה לתא53, itop54 ו triamf 55 פותחו עבור crispr יעיל/Cas9 משלוח לתוך סוגי תאים מגוונים כמו גם בעלי חיים ומינים צמח24,25,26,56,57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63. מכיוון שאינם קידוד רצפי DNA הם נקודות חמות של וריאציות גנטיות64, בדיקת נוכחות של snps משותף/indels ביעד ורצפי פאם השכנה רלוונטי במיוחד בעת עיצוב grna כי מטרות הרגולציה רכיבים.

צוואר בקבוק ב CRISPR/Cas9 הגנום עריכה כרוכה הקרנת שיבוטים מוטציה הרצוי במספר רב של דגימות. אנו מועסקים ה-PCR הפלורסנט בשילוב עם אלקטרופורזה ג’ל קפילר עבור ההקרנה כמו מוטציה היעד הוא מחיקה גנומית קטנה של כ 300 bp. שיטה זו מהירה ורגישה וניתן לבצעה בצורה של תפוקה גבוהה. כמו כן, שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של רמות מוטציה וגדלי מחיקה בו זמנית. בנוסף, קיימת תמיכה בניתוח של קטעי PCR המסומנים בצבעי פלורסנט שונים. אנחנו כבר באופן שגרתי באמצעות טכניקה זו כדי גנוטיפ הוספות/מחיקות קטנות מיאלואידית מיאלואיד65,66. בניסיון שלנו, אנחנו יכולים לזהות בעקביות גדלי קטעים שונים על ידי 4 bp עם דיוק גבוה ועומס מוטציה עד ~ 3%. עם זאת, יש לציין כי שיטה זו יש מגבלת גודל קטע של 1,200 bp, ולכן הוא אינו מתאים להקרנה של מחיקות גדולות. כמו כן, לא ניתן לזהות החלפות בסיס (כתוצאה מגודל המקטע ללא שינוי) ומאירועים פוטנציאליים מחוץ ליעד באזורים גנומית אחרים. עבור האחרון, רצף הגנום היקר כולו נדרש כדי באופן מקיף שינויים בלתי רצויים גלובלי בפרופיל במשובטים היעד. כדי לאמץ את הגישה הנוכחית שלנו לחקירה של רצפים גדולים שאינם מצפינה קידוד (> 1000 bp), מחיקה מפורטת וניתוח מוטארזיס של אתרי כריכה של שעתוק הגורם באמצעות מבחנה שניתן לבצע מראש כדי להתוות את האזור הפונקציונלי מינימלי עבור CRISPR/Cas9 עריכה18.

כמו גנים רבים מכילים יותר מאשר אחד היזמים3,4, חשוב להיות מודעים לקיומו של יזמים חלופיים במקום הגן היעד כמו מניפולציה אלמנטים הרגולציה עשוי להשפיע על היזמים הדיפרנציאלי. לפיכך, יש למדוד משתנים שמקורם ביזמים שונים כדי להעריך את כל התגובות הספציפיות ליזם. השימוש של TaqMan בדיקה המבוססת על המחקר הוא מועדף על SYBR גרין בגלל ספציפיות יותר ומחדש. אם מערכת ה-PCR הדיגיטלית המתקדמת יותר זמינה, ניתן לבצע את התמליל בצורה מדויקת יותר ללא הצורך בבניית עקומות סטנדרטיות.

שיקול חשוב בביצוע הניסויים CRISPR/Cas9 בתור תאים סרטניים הוא הפלויידי והיעד מספר העתק של התאים בשימוש כמעט כל התאים הסרטניים הנמל שינויים גנטיים כולל וריאציות מבנה העתק מספר. במקרה שלנו, OCI-AML3 יש היפרדיפלואיד קריוטיפ עם 45 כדי 50 כרומוזומים. גם, קו התא נמצא לשאת מספר RUNX1 עותק רגיל כפי שנחשף מתוך האנציקלופדיה קו התא של סרטן67 ו הזריחה במחקר היברידיזציה באתרו18. בעת המיקוד של גן עם רווח מספר עותק, ייתכן ששיטת המסירה צריכה להיות ממוטבת כדי לספק רמות מספיקות של רכיבי CRISPR עבור העריכה. כמו כן, שיבוטים נוספים צריך להיות מוקרן כדי לזהות את הנוק אאוט מלאה. חשוב מכך, זה הוכח כי מיקוד באזורים גנומית מוגברת, במיוחד אלה הנגרמים על ידי הסדרים מבניים, יכול להפעיל התגובות נגד גנים עצמאיים נגד ההתרבות בתאי הסרטן, המוביל לתוצאות שווא-חיוביים בגנים מחקרים פונקציונליים68,69,70. בהקשר זה, גישות חלופיות כמו RNA התערבות (RNAi) הסתרה ו/או cDNA ביטוי יתר צריך להיות מועסק כדי לאמת את ממצאי CRISPR. כמו כן, יש להשתמש בקווי תא מרובים כדי להימנע מפענוח שגוי של אפקטי עריכה ייחודיים לקווי הטלפון אך לא עצמאיים.

מערכת CRISPR/Cas9 יש מהפכה בסיסי מחקר טרנסלtional על ידי מתן אמצעי פשוט ויעיל לעריכת הגנום. כאן אנו מדגימים את הקלות של השימוש CRISPR/Cas9 כדי לשבש משתיק קול בלתי הטרונית ללימודי הטרנסטרונים קו התאים הסרטניים. טכניקה זו מאפשרת לימוד של CREs ברמת ה-DNA ומציעה את ההזדמנויות לבחון את פונקציות היצור בהקשר האנדוגניים ולא את הגנים כתב הטרוולוגי המסורתי. לאחרונה, מערכת העריכה של RNA מבוססי CRISPR יש גם זיהה71 ו עשוי לשמש כלי הרומן ללמוד cres על ידי פילוח של RNA המועתק מן האלמנטים הרגולטורים. על ידי שילוב עם טכניקות לכידת כרומוזום קונפורמציה, CRISPR/Cas9 בהחלט לעזור לפענח את עורבות של CREs בארגון הגנום שונה ביטוי גנים המקושרים בעיות בריאות שונות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לפרופ ‘ מינדן (הנסיכה מרגרט מרכז הסרטן, רשת הבריאות של האוניברסיטה, טורונטו, קנדה) לאספקת קו התא OCI-AML3. גם, המחברים רוצים להודות כלי הליבה של הגנומיקה סרטן ו פתוביולוגיה (האוניברסיטה הסינית של הונג קונג) למתן מתקנים וסיוע תמיכה של מחקר זה.

Materials

0.2 cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad 1652086
1×TE buffer, pH7.5 Integrated DNA Technologies 11-01-02-02
10mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific 18427013
3500 Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405673
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer Thermo Fisher Scientific None
7300 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific None
7300 System SDS Software Thermo Fisher Scientific None Version 1.3.1
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system Bio-Rad 1652660
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well Thermo Fisher Scientific CS11205
crRNA-1 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
crRNA-2 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
Deionized formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
Electroporation Enhancer Integrated DNA Technologies 1075915
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270098
Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32857
GeneMapper Software 5 Thermo Fisher Scientific 4475073
GeneScan 600 LIZ Size Standard Thermo Fisher Scientific 4408399
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
PBS, 10X Solution, pH7.4 Affymetrix 75889
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher Scientific 11304029
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease Integrated DNA Technologies 1081058 Components of the Cas9/gRNA complex
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 31800-022
RPMI 1640 medium without phenol red Thermo Fisher Scientific 11835030
RUNX1a TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs04186042_m1
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs00231079_m1
RUNX1c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs01021966_m1
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher Scientific 18080051
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4304437
tracrRNA Integrated DNA Technologies 1072533 Components of the Cas9/gRNA complex
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Unlabeled PCR reverse primer Thermo Fisher Scientific None
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maston, G. A., Evans, S. K., Green, M. R. Transcriptional regulatory elements in the human genome. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 29-59 (2006).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nature Reviews Genetics. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Research. 16 (1), 55-65 (2006).
  4. Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends in Genetics. 19 (11), 640-648 (2003).
  5. West, A. G., Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: many functions, many mechanisms. Genes & Development. 16 (3), 271-288 (2002).
  6. Riethoven, J. J. Regulatory regions in DNA: promoters, enhancers, silencers, and insulators. Methods in Molecular Biology. 674, 33-42 (2010).
  7. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  8. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  9. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  10. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  11. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  12. Bernstein, B. E., et al. The NIH roadmap epigenomics mapping consortium. Nature Biotechnology. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  13. Zhou, S., Treloar, A. E., Lupien, M. Emergence of the Noncoding Cancer Genome: A Target of Genetic and Epigenetic Alterations. Cancer Discovery. 6 (11), 1215-1229 (2016).
  14. Khurana, E., et al. Role of non-coding sequence variants in cancer. Nature Reviews Genetics. 17 (2), 93-108 (2016).
  15. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Molecular Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  16. Willis, T. G., Dyer, M. J. The role of immunoglobulin translocations in the pathogenesis of B-cell malignancies. Blood. 96 (3), 808-822 (2000).
  17. Gröschel, S., et al. A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in leukemia. Cell. 157 (2), 369-381 (2014).
  18. Cheng, C. K., et al. RUNX1 upregulation via disruption of long-range transcriptional control by a novel t(5;21)(q13;q22) translocation in acute myeloid leukemia. Molecular Cancer. 17 (1), 133 (2018).
  19. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  20. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual Review of Genetics. 45, 273-297 (2011).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  22. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  23. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  24. Cho, S. W., Lee, J., Carroll, D., Kim, J. S., Lee, J. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Genetics. 195 (3), 1177-1180 (2013).
  25. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  26. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, 04766 (2014).
  27. Quentmeier, H., et al. Cell line OCI/AML3 bears exon-12 NPM gene mutation-A and cytoplasmic expression of nucleophosmin. Leukemia. 19 (10), 1760-1767 (2005).
  28. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  29. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  30. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  31. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  32. Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. Journal of Visualized Experiments. (122), e55586 (2017).
  33. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  34. Sood, R., Kamikubo, Y., Liu, P. Role of RUNX1 in hematological malignancies. Blood. 129 (15), 2070-2082 (2017).
  35. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  36. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  37. Wright, J. B., Sanjana, N. E. CRISPR Screens to Discover Functional Noncoding Elements. Trends in Genetics. 32 (9), 526-529 (2016).
  38. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  39. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  40. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  41. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  42. Chen, C., Fenk, L. A., de Bono, M. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans by CRISPR-targeted homologous recombination. Nucleic Acids Research. 41 (20), 193 (2013).
  43. Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, 16 (2015).
  44. Svitashev, S., et al. Targeted Mutagenesis, Precise Gene Editing, and Site-Specific Gene Insertion in Maize Using Cas9 and Guide RNA. Plant Physiology. 169 (2), 931-945 (2015).
  45. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  46. Ye, L., et al. Genome editing using CRISPR-Cas9 to create the HPFH genotype in HSPCs: An approach for treating sickle cell disease and β-thalassemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10661-10665 (2016).
  47. Gabriel, R. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nature Biotechnology. 29 (9), 816-823 (2011).
  48. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nature Methods. 9 (8), 805-807 (2012).
  49. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  50. Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (11), 2868-2873 (2016).
  51. Gundry, M. C., et al. Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9. Cell Reports. 17 (5), 1453-1461 (2016).
  52. Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
  53. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
  54. D’Astolfo, D. S., et al. Efficient intracellular delivery of native proteins. Cell. 161 (3), 674-690 (2015).
  55. Yen, J., et al. TRIAMF: A New Method for Delivery of Cas9 Ribonucleoprotein Complex to Human Hematopoietic Stem Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16304 (2018).
  56. Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
  57. Martin, A., et al. CRISPR/Cas9 mutagenesis reveals versatile roles of Hox genes in crustacean limb specification and evolution. Current Biology. 26 (1), 14-26 (2016).
  58. Menoret, S., et al. Homology-directed repair in rodent zygotes using Cas9 and TALEN engineered proteins. Scientific Reports. 5, 14410 (2015).
  59. Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
  60. Malnoy, M., et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Frontiers in Plant Science. 7, 1904 (2016).
  61. Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
  62. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 7, 13274 (2016).
  63. Shin, S. E., et al. CRISPR/Cas9-induced knockout and knock-in mutations in Chlamydomonas reinhardtii. Scientific Reports. 6, 27810 (2016).
  64. 1000 Genomes Project Consortium et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  65. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. The New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  66. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations fro an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  67. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
  68. Aguirre, A. J., et al. Genomic Copy Number Dictates a Gene-Independent Cell Response to CRISPR/Cas9 Targeting. Cancer Discovery. 6 (8), 914-929 (2016).
  69. Munoz, D. M., et al. CRISPR Screens Provide a Comprehensive Assessment of Cancer Vulnerabilities but Generate False-Positive Hits for Highly Amplified Genomic Regions. Cancer Discovery. 6 (8), 900-913 (2016).
  70. Gonçalves, E., et al. Structural rearrangements generate cell-specific, gene-independent CRISPR-Cas9 loss of fitness effects. Genome Biology. 20 (1), 27 (2019).
  71. Abudayyeh, O. O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).

Tags

Keyword Extraction:RUNX1Intronic SilencerCRISPR/Cas9 RibonucleoproteinAcute Myeloid LeukemiaCis-regulatory ElementsGene ExpressionTranscriptional RoleHematopoietic CellsElectroporationCas9 NucleaseGRNARNP ComplexFragment Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cheng, C., Wong, T. H., Yung, Y., Chan, N. C., Ng, M. H. Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (151), e60130, doi:10.3791/60130 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image