Summary

Establecimiento de un modelo de ojos secos severos mediante dacrioadenectomía completa en conejos

Published: January 08, 2020
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Summary

Se presenta un enfoque novedoso para inducir la enfermedad crónica del ojo seco en los conejos mediante la extirpación quirúrgica de todas las glándulas lagrimales orbitales. Este método, distinto de los reportados anteriormente, produce un modelo estable y reproducible de ojo seco deficiente acuoso adecuado para estudiar fisiología lagrimal y fisiopatología y terapia ocular.

Abstract

La enfermedad del ojo seco (DED) es una enfermedad compleja con múltiples etiologías y síntomas variables, que tiene la inflamación de la superficie ocular como su paso fisiopatológico clave. A pesar de los avances en nuestra comprensión de desenros, siguen existiendo importantes lagunas de conocimiento. Los avances son limitados en parte debido a la falta de modelos informativos de animales. Los autores informaron recientemente sobre un método de DED inducido por la inyección de todos los tejidos de la glándula lagrimal orbital (LG) con la lectina concanavalina A. Aquí, informamos de un modelo novedoso de DED deficiente acuoso basado en la resección quirúrgica de todos los tejidos orbitales LG (dacryoadenectomía). Ambos métodos utilizan conejos debido a su similitud con los ojos humanos en términos del tamaño y la estructura de la superficie ocular. Una semana después de la extracción de la membrana nictitando, el LG superior orbital fue extirpado quirúrgicamente bajo anestesia, seguido por la extirpación del LG superior palpebral, y finalmente la extirpación de la inferior LG. Dacryoadenectomía indujo DED severo, evidenciado por un marcada reducción en la prueba de tiempo de ruptura de desgarro y la prueba de desgarro de Schirmer, y aumentó significativamente la osmolaridad del desgarro y la tinción de bengala rosa. La DED inducida por Dacryoadenectomía duró al menos ocho semanas. No hubo complicaciones y los animales toleraron bien el procedimiento. La técnica puede ser dominada relativamente fácilmente por aquellos con experiencia quirúrgica adecuada y apreciación de la anatomía relevante del conejo. Dado que este modelo recapitula las características de la DED acosada por los acuosos humanos, es adecuado para estudios de homeostasis de superficie ocular, DED y terapias candidatas.

Introduction

Las lágrimas son necesarias para la protección de la superficie ocular y para el mantenimiento de las propiedades ópticas de la córnea. Constan de tres capas: un recubrimiento de mucina interna, un componente acuoso medio y una superposición de lípidos1. La capa de mucina se produce predominantemente en las células de copa de la conjuntiva, el componente acuoso predominantemente en las glándulas lagrimales (LGs), y la capa lipídica predominantemente en las glándulas Meibomian1,2. Los GE orbitales son la fuente principal del componente acuoso de las lágrimas y de muchas de las proteínas que protegen la superficie del ataque bacteriano3. Las enfermedades de la superficie ocular se adecuen cuando la producción de lágrimas acuosas disminuye por debajo de un nivel crítico, privando a las superficies epiteliales del ojo del componente acuoso y a los componentes lagrimales cruciales, incluidos los factores de crecimiento, la lisozima y la lactoferrina. En los casos de disminución de la producción de lágrimas por los LGs, los tejidos conjuntival y corneal se someten a adaptaciones para compensar el ambiente alterado.

Comprender la contribución del componente lagrimal derivado de los LC orbitales y los mecanismos compensatorios de la superficie ocular cuando esto carece de impactos nuestra apreciación de la fisiología y fisiopatología del segmento anterior del ojo y, más ampliamente, de la salud y la enfermedad en todo el mundo. El enfoque experimental de estas cuestiones requiere un modelo animal informativo. En consecuencia, varios grupos han intentado desarrollar modelos animales en los que se eliminan los GLÚ orbitales, facilitando así la evaluación del papel de las lágrimas en la salud ocular. Uno de estos modelos fue reportado recientemente para el ratón4. El conejo ofrece, sin embargo, muchas ventajas distintas sobre los modelos de roedores, incluyendo estructuras anatómicas e histológicas similares de la LG, y tal vez lo más importante, tamaño similar y superficie de la córnea y los tejidos conjuntivales en comparación con sus homólogos humanos3.

La creación de enfermedad acuosa de ojo seco deficiente (DED) por resección quirúrgica del tejido LG en conejos no es nueva. Numerosos informes describen la resección de tejidos LG con un éxito variable reflejado en los cambios variables en la producción de lágrimas medidos por la prueba de desgarro de Schirmer5,6,7,8. Una comprensión profunda de la anatomía relevante del conejo y la claridad sobre la terminología anatómica son muy útiles en la reproducción de este método. A continuación se ofrece una visión general completa de ambos.

Anatomía de las glándulas lagrimales

El conejo tiene dos LG orbitales: el LG inferior más grande (ILG) y el superior más pequeño LG (SLG; Figura 1). El ILG se extiende a lo largo del aspecto inferior y posterior del borde orbital. Con la excepción del tamaño variable, la parte anterior del ILG tiene un aspecto bulboso bastante uniforme que puede ser visto como una protuberancia en la piel bajo el globo(Figura 2). Debido a su aspecto característico en relación con el resto de la glándula, se conoce como la “cabeza” del ILG. Una porción de la cabeza se envuelve y se encuentra en la superficie externa del hueso cigomático. Esto sirve como un punto de referencia útil en la biomicroscopía por ultrasonido para guiar las inyecciones en el ILG. El resto de la cabeza reside más mediamente9 en la órbita.

Debido a la apariencia característica de la parte restante del ILG, que es larga y delgada, este segmento se conoce como la “cola”. La cola corre a lo largo del borde orbital inferior, desde la cabeza del ILG hasta el borde orbital donde termina con anatomía variable en el borde orbital inferior y posterior(Figura 3A). La cola se encuentra profunda (medial) al hueso cigomático separado del contenido orbital por una banda fascial durante la mayor parte de su curso hasta que alcanza el borde posterior de la órbita donde se extiende una vez más sobre la superficie externa del hueso cigomático. El ILG recibe su suministro de sangre de las ramas de la arteria carótida.

El SLG tiene dos componentes análogos al humano. Uno es el LG superior palpebral (PSLG), que reside en el párpado posterior superior medial a la placa tarsal. Parece bulboso en la naturaleza y tiene numerosas aberturas punctadas que drenan el líquido lagrimal acuoso que se ve más fácilmente cuando se cubre con 2% de fluoresceína(Figura 3B).

El segundo es el SUPERIOR orbital LG (OSLG), que reside en una posición medial en la órbita superior(Figura 3C). Debido a su posición cerca de la línea media del cráneo, ha sido imposible identificarlo con éxito utilizando enfoques quirúrgicos externos de la órbita temporal o inferior. En muestras de necropsia fresca o casos quirúrgicos, esta glándula se puede propasar a través de la incisión posterior ubicada en la superficie dorsal del cráneo cuando se aplica una presión media suave al globo terráqueo. El prolapso de este tejido glandular se puede documentar con biomicroscopía por ultrasonido.

PsLG y OSLG son estructuras contiguas. El OSLG es una estructura tubuloalveolar cuya arquitectura ductal se une al conducto excretor principal. Este conducto pasa por debajo de la cresta supra-orbital y corre en los tejidos del párpado superior terminando en el PSLG. A lo largo del conducto excretor, se ha identificado el tejido glandular consistente con las descripciones originales de Davis10 (Figura 3D).

Una nota sobre terminología

Excelentes y completas descripciones anatómicas utilizan terminología variable, así. La anatomía orbital clásica de Davis define sólo un LG10superior e inferior. Sin embargo, su descripción del LG superior detalla claramente las partes más específicamente definidas aquí como el PSLG y OSLG, mientras que su descripción del LG inferior detalla las partes definidas aquí como la cabeza y la cola del ILG. Un atlas anatómico más reciente y completo11 define estos tejidos como la glándula cigomática y el accesorio LG. El término “glándula lagrimal” se utiliza aquí para comprender el mencionado PSLG y OSLG. Esta terminología es más adecuada para reproducir este método sin confusión indebida.

Protocol

Todos los estudios en animales vertebrados se completaron de acuerdo y cumplen con todas las directrices regulatorias e institucionales pertinentes. Todos los estudios fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Stony Brook y realizados de acuerdo con la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. 1. Animales y alojamiento Utilice conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW) que pesen 2 x 3 kg. Casa de conejos individualmente en un ambiente estrictamente controlado: temperatura (65 s 5 oF), humedad (45 x 5%) e iluminación (ciclo de encendido/apagado de 12 h).NOTA: Debido a comportamientos agresivos que a menudo se exhiben entre conejos que están alojados en grupo, mantenga a los animales en jaulas individuales para evitar lesiones oculares involuntarias. Dar a los conejos acceso ilimitado a la comida y el agua de conejos estándar. No proporcionar ningún otro enriquecimiento dietético con el fin de prevenir la suplementación involuntaria de vitamina A que podría afectar el ojo seco. Aclimatar conejos al menos dos semanas antes de registrar los parámetros DED. 2. Extirpación de la membrana nictiladora NOTA: Para simplificar, la técnica para el ojo derecho se describe a continuación. Complete este procedimiento en el ojo izquierdo de una manera idéntica. Retire la membrana nictiante bilateralmente durante el período de aclimatación (generalmente la primera semana). Coloque el conejo en una bolsa de sujeción del tamaño adecuado. Administrar una inyección subcutánea de acepromaz (1 mg/kg) sobre los hombros utilizando una jeringa de 1 cc y una aguja de 26 G para sedar el conejo. El punto final para esta sedación leve es cuando el animal mantiene una posición relajada de la cabeza sin movimientos normales de escaneo y sus orejas ya no están completamente erguidas. Con una micropipeta, aplicar 25 ml de lidocaína sin conservantes (1%) a los ojos. Inserte un espéculo de la tapa del alambre entre los párpados. Sujete la membrana nictitante en su ápice con 0,3 fórceps (o equivalente) y tire de ella sobre la superficie corneal. Inyectar 1% de lidocaína con 1:100.000 epinefrina en el espacio subconjuntivo de la membrana nictinada utilizando una aguja de 26 G. Inyectar aproximadamente 0,3 ml para formar un blebe de tamaño modesto sobre la membrana nictiladora. Los volúmenes de inyección de más de 1 ml están dentro de un rango de dosis segura para conejos (2 x 4 mg/kg). Retire el espéculo del cable. Espere aproximadamente 5 minutos para que la lidocaína y la epinefrina surtan efecto. Durante este tiempo, realice el mismo procedimiento en el otro ojo. Vuelva a colocar el espéculo de la tapa del cable. Sujete y extienda la membrana nicitante sobre la superficie corneal utilizando 0,3 fórceps. Cortar la membrana en su base con tijeras de tenotomía o equivalente.NOTA: El sangrado suele ser mínimo, pero mantenga cerca una unidad de cauterio de batería de alta temperatura y úselo según sea necesario para minimizar el sangrado. La presión directa sobre la base de corte de la membrana nictiladora también se puede utilizar para detener el sangrado pequeño si se produce. Retire el espéculo de la tapa del cable. Coloque un ung mento antibiótico tópico (neomicina, polimicina, bacitracina e hidrocortisona) sobre la superficie corneal. Realice un procedimiento idéntico al otro ojo como se indica en el protocolo. Colocar animales de nuevo en jaulas individuales y dejar sanar durante al menos una semana, o hasta que la superficie conjuntival se haya curado completamente desde un punto de vista clínico, antes de realizar más ensayos o intervenciones.NOTA: La curación clínica completa está indicada por la falta de hinchazón, inyección o secreción de las superficies conjuntivales. Los animales deben mantener los ojos abiertos normalmente, sin la presencia de ptosis protectora. 3. Medición de los parámetros del ojo seco y recogida de muestras de lagrimal Mida los siguientes parámetros DED, según corresponda al protocolo experimental: osmolaridad lagrimal, tiempo de ruptura de desgarro, prueba de desgarro de Schirmer y tinción de bengala rosa. Realizarlos como se describió anteriormente12, con un equipo de al menos dos investigadores.NOTA: Un equipo de al menos dos investigadores permite la medición eficiente de grupos más grandes de animales (6 o más) durante el mismo tiempo de reloj, evitando así que la posible variación circadiana afecte a los resultados. 4. Preparación quirúrgica y anestesia Animales ligeramente sedados colocados en una bolsa de sujeción con acromazina subcutánea como arriba (1 mg/kg). Retire todo el pelaje en la cara y la superficie dorsal del cráneo para visualizar los puntos de referencia quirúrgicos. Recortar el pelaje con tijeras de corte dejando pelaje fino residual de aproximadamente 1 mm de longitud(Figura 4A,izquierda). Retire todo el pelaje residual usando crema depilatoria suave siguiendo las instrucciones del fabricante(Figura 4A, derecha). Marque los sitios de incisión quirúrgica con una pluma quirúrgica. Identificar el sitio de la incisión sobre la incisión posterior aplicando presión medial en el globo terráqueo causando que se desarrolle una pequeña protuberancia en la piel sobre la incisión posterior del prolapso del OSLG. Hacer una marca lineal de 2 cm en la dirección anterior/posterior en la piel sobre la superficie dorsal del cráneo directamente sobre este sitio con una pluma de marcado quirúrgica. Al planificar la incisión para la eliminación del ILG, marque una línea larga y curvilínea alrededor del ojo (1 cm del margen inferior y temporal de la tapa) que se extiende desde la órbita posterior (temporal) hasta el canthus anterior (medial). Haga que el marcado se extienda a lo largo de la órbita posterior hasta el nivel del canthus medial o simplemente superior a esto(Figura 4B). En algunas disecciones, se conectarán las incisiones para eliminar el OSLG y el ILG.NOTA: Cuando realice una cirugía bilateral, marque ambas órbitas en este momento. Recortar un parche de piel de 2 a 3 cm de ancho con tijeras sobre la superficie lateral de cada muslo para permitir la colocación de una placa de cauterización monopolar. Aplique gel de ultrasonido para garantizar un buen contacto eléctrico con la placa de cauterización monopolar. Coloque un catéter intravenoso (IV) de 25 G en una de las venas marginales del oído para administrar medicamentos o líquidos si es necesario. Dar xilazina subcutánea (1 mg/kg) y ketamina IV (15 mg/kg) para la inducción inicial de la anestesia (a través del acceso IV).NOTA: Si el conejo se seda previamente con acepromazina suficiente para retener el punto final descrito en el paso 2.3, utilice la sedación de máscara de gas con isoflurano como alternativa. Coloque una máscara laríngea en las vías respiratorias que se mantiene en su lugar usando una banda elástica o cuerda para asegurar y mantener las vías respiratorias. Conecte la máscara a la máquina de anestesia con el flujo de oxígeno establecido en 1 L/min. Establezca el isoflurano en un 5% inicialmente y luego reduzca según lo tolerado en función del nivel de sedación animal. Mantener el isoflurano en o por encima del 2% hasta el cierre final de la herida.NOTA: Evaluar el nivel de sedación mediante el seguimiento de la frecuencia respiratoria y los movimientos en respuesta a estímulos quirúrgicos o dolorosos. Aumente la profundidad de la anestesia si la frecuencia respiratoria aumenta por encima de 10 respiraciones por minuto, si el conejo comienza a masticar el mantenedor de las vías respiratorias, o si se observa algún movimiento en respuesta a estímulos dolorosos. Supervise la oximetría de pulso, la capnografía, la presión arterial, la temperatura corporal rectal y la frecuencia cardíaca utilizando un dispositivo de monitoreo multiparámetro u otros dispositivos apropiados. Supervise los signos vitales continuamente durante el procedimiento y registre cada 10 a 15 minutos. Coloque el conejo en la mesa del quirófano (OR) sobre una almohadilla de calefacción para evitar la hipotermia. Incline la mesa en una posición inversa de Trendelenburg a aproximadamente 30o para minimizar el sangrado. Preparar el área quirúrgica con una solución de povidona-yodo diluida a media resistencia con agua estéril y cortina para mantener un campo estéril. 5. Dacrioadenectomía quirúrgica completa NOTA: La dacrioadenectomía quirúrgica completa, como se describe en el presente documento, se realizó utilizando 0,3 fórceps de tejido, tijeras de tenotomía, fórceps de tejido no dientes y tijeras. Estos instrumentos se pueden intercambiar con instrumentos similares que realizan la misma función en función de la preferencia del cirujano. Quite primero el OSLG. Infiltrar los sitios de incisión (líneas de la pluma de marcado quirúrgico y tapa posterior superior) con una mezcla de 50:50 de lidocaína al 2% con 1:100.000 epinefrina y 0,5% de bupivacaína utilizando una jeringa de 5 cc con una aguja de 30 G(Figura 5A).NOTA: El tamaño de la jeringa y la aguja no son críticos. Utilice una aguja de Colorado conectada a una unidad electroquirúrgica para hacer las incisiones cutáneas a lo largo de las marcas quirúrgicas. Los ajustes pueden variar en función de la respuesta clínica y, por lo general, están entre 10 y 15 unidades tanto para el corte como para la coagulación(Figura 5B). Aplicar tensión opuesta a través de la incisión de la piel para separar los tejidos y exponer las fibras musculares frontoscutularis subyacentes. Aplicar presión medial en el globo para ayudar a la visualización del OSLG, visto como tejido abultado situado sólo medial o profundo a las fibras musculares frontoscutularis. Si es necesario, mueva estas fibras musculares hacia un lado para exponer la incisión subyacente. Con fórceps dentados (0,3) y tijeras de capsulotomía, retraiga y corte suavemente la cápsula fibrosa que cubre el OSLG. El OSLG normalmente tiene un color bronceado pálido(Figura 5C). Usando fórceps dentados o no dientes, agarre el tejido de la glándula OSLG y tire suavemente de él a través de la incisión superior usando una técnica de “mano sobre mano”. Corte bandas pequeñas y fibrosas usando tijeras de capsulotomía para liberar la glándula de su posición en la órbita(Figura 5D).NOTA: A medida que se extrae el tejido de la glándula OSLG, comenzará a fusionarse en una estructura grande similar a un tubo (conducto excretor principal). Cuando la glándula se ha eliminado tan completamente como sea posible, utilice cautery generoso con la aguja de Colorado para crear char de tejido, truncando la glándula dentro de la incisura tan profundamente como sea posible. Esto servirá más tarde como un punto de referencia confirmatorio durante la eliminación del PSLG. Retire el PSLG. Evert el párpado superior usando un aplicador con punta de algodón. El extremo bulboso del PSLG suele ser fácilmente visible.NOTA: En algunas disecciones anatómicas, puede ser posible visualizar el conducto excretor principal como una estructura lineal pálida de aproximadamente 1 o 2 mm de ancho. Enganche el PSLG con fórceps dentados (0,3) y retírelo de la superficie del párpado mientras usa tijeras de capsulotomía para cortar alrededor de su base separándolo del tarso subyacente(Figura 6A). Controle el sangrado moderado con el cauterio monopolar. Aplique tracción continua sobre el tejido separado para mantener un plano tisular para la disección. Esto permitirá que el conducto excretor principal del SLG también se retire(Figura 6B).NOTA: A medida que se lleva a cabo la disección, normalmente avanzará hacia el borde orbital superior donde es posible ver las marcas de cauterización que quedan atrás de la eliminación del OSLG más superior y medialmente localizado. Reseque el ILG. Permita al menos 5 minutos para que el anestésico local surta efecto. Incise la piel, el músculo depresor de la palpebra inferior, la parte cigomaticolabial del músculo cigomático y el músculo orbicularis con la aguja de microdisección de Colorado y seseparan en cuanto al OSLG en la sección 5.1. Mantener la hemostasis con el cauterio monopolar. A medida que la incisión se lleva más profundo a través de la marcación de la piel, busque el heende de un plano fascial sobre el hueso cigomático o parte superficial del músculo maseter. En este punto, mantenga el plano tisular y llévelo superiormente hacia el borde orbital usando la aguja de Colorado para el corte(Figura 7A).NOTA: Con el propósito de identificar el ILG, es más fácil realizar esta parte de la disección sobre la cabeza del ILG que es típicamente inferior al limbo anterior del ojo. Después de identificar e incijar la cápsula que rodea el ILG, identifique el tejido bronceado del ILG. Sólo la parte anterior de la cabeza ILG será visible(Figura 7B). Sin embargo, la cabeza se puede seguir medialmente a medida que pasa por debajo del arco cigomático y pasa a la cola(Figura 7C). Utilice tijeras de tenotomía para cortar el tabique orbital a lo largo del borde inferior exponiendo la porción más posterior de la cola de ILG. Una vez identificado el plano tisular, extienda la disección posterior a lo largo de toda la línea de incisión(Figura 7D).NOTA: El conducto del ILG pasa a través de los tejidos conectivos fibrosos inferiores para entrar en el espacio conjuntivo inferior en el aspecto temporal de la tapa. En el borde posterior, la cola del ILG puede tener diferentes configuraciones anatómicas. A veces termina inferior al canthus posterior (lateral), mientras que en otras disecciones se extiende más superiormente alrededor de la órbita temporal. Tenga mucho cuidado para evitar daños involuntarios en el suministro de sangre, que el ILG recibe de las ramas de la arteria carótida. El suministro de sangre se puede ver durante esta parte de la disección(Figura 7E). En los casos en que la cola termina bajo el canthus posterior (lateral), puede ser necesario bisecar la parte temporal del músculo frontoscutular para exponer la cola del ILG, que se encuentra a lo largo del hueso cigomático. Después de que todo el ILG haya sido aislado y expuesto, retírelo. Debido a su gran tamaño, a menudo es preferible cortar la glándula por la mitad con tijeras y quitar la cabeza por separado de la cola. Proceda con mucha precaución al quitar la cabeza del ILG, ya que se encuentra inmediatamente adyacente a un seno venoso grande en la órbita. Aunque no se ha producido sangrado de esta estructura durante las resecciones quirúrgicas, tiene amplias ayudas hemostáticas presentes para mitigar este riesgo. Después de la extracción de todo el tejido de la glándula, cierre el plano profundo del tejido conectivo con múltiples suturas de tereftalato de etileno 5-0 interrumpidas. Cierre los músculos superficiales y la piel con una sutura de 6-0 poliglactina 910(Figura 7F)usando 0,3 fórceps de tejido y un controlador de aguja. 6. Atención postprocesal Desablavar a los animales y limpiar los sitios quirúrgicos con agua estéril. Aplique antibiótico oftálmico tópico y pomada de esteroides (neomicina, polimicina, bacitracina e hidrocortisona) a las incisiones. Continúe con esta aplicación dos veces al día durante 2 días. Dar una inyección subcutánea de 20 ml de salina normal sobre los omóplatos utilizando una aguja de 26 G. Dar buprenorfina subcutánea 0,01 mg/kg o ketoprofeno 3 mg/kg para el control del dolor utilizando una jeringa de 1 cc y una aguja de 30 G.NOTA: Los animales deben volver a su ingesta dietética normal y a sus actividades en un plazo de 1 a 2 días. Los conejos deben evaluarse al menos semanalmente en busca de signos clínicos de infección, como lo demuestran la hinchazón progresiva, el dolor, el eritema, el calor o la descarga purulenta sobre los sitios de incisión. También se deben observar animales para asegurarse de que no comienzan a rayar los sitios de incisión/líneas de sutura. Recortar todas las garras antes de la dacryoadenectomía puede ser útil a este respecto. Si se observa rascando las líneas de incisión, se pueden utilizar collares protectores estándar para prevenir lesiones. Invierta la anestesia. Retire el mantenedor de las vías respiratorias después de que el animal responda a los estímulos y comience a mostrar masticación espontánea, pero antes de que el mantenedor de las vías respiratorias pueda dañarse. Monitorear a los animales durante aproximadamente 1 x 2 h o hasta que se hayan recuperado completamente de la anestesia como lo demuestra el movimiento espontáneo en sus jaulas. Evaluar a los animales para el dolor y tratar adecuadamente. Permita que los animales se recuperen durante al menos 1 semana después de la cirugía antes de tomar cualquier medida clínica de DED.

Representative Results

El método completo de dacryoadenectomía descrito aquí se realizó en 8 animales. Requiere un grado moderado de habilidad quirúrgica. El tiempo quirúrgico promedió alrededor de 2,2 h para la cirugía bilateral, excluyendo la extracción de la membrana nictipendiente, que se hizo por separado y requirió <10 minutos. No hubo víctimas mortales ni complicaciones intraoperatorias y ningún conejo requirió ninguna ayuda hemostática que no fuera una carriola modesta. Nuestro enfoque quirúrgico indujo con éxito el ojo seco en todos los ojos. Esto fue confirmado por un panel de marcadores clínicos y de laboratorio de DED (Tabla 1). Durante las 8 semanas de observación, el TBUT medio fue suprimido por más del 75% de los niveles preoperatorios (p < 0.0001 para todos los puntos de tiempo). Del mismo modo, la prueba de desgarro de Schirmer disminuyó en aproximadamente un 50%, permaneciendo así durante las 8 semanas de observación; no mostró ninguna tendencia a la recuperación durante el período de seguimiento. Postoperatoriamente, la osmolaridad lagrimal mostró un aumento del 10% consistente con DED, sostenido durante al menos 8 semanas postoperatoria. La tinción de bengala rosa de la córnea también aumentó y no mostró signos de recuperación durante las 8 semanas de seguimiento(Figura 8). Todos los ojos sometidos a una dacrioadenectomía completa mostraron una marcada reducción en el número de células de la copa y cambios epiteliales consistentes con el ojo seco (citología de impresión conjuntival). Figura 1: Anatomía de la glándula lagrimal del conejo (ojo derecho). La glándula lagrimal superior orbital (OSLG) se compone de una parte orbital más grande y un componente palpebral más pequeño. La glándula lagrimal inferior más grande (ILG) se compone de las porciones anterior/cabeza y posterior/cola. Los ejes de coordenadas muestran la terminología utilizada para todas las descripciones de orientación utilizadas en el texto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Ubicación de la cabeza del ILG. La vista lateral de la cara derecha después de la eliminación del pelaje. Una protuberancia en el contorno de la piel (indicada por flechas gruesas) inferior a la órbita anterior indica la ubicación de la cabeza del ILG que se encuentra en la superficie externa del hueso cigomático en esta ubicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Las glándulas lagrimales orbitales. (A) La glándula lagrimal inferior derecha (ILG) después de manchar con el tinte azul Evans que muestra la proximidad de la cola del ILG (flecha roja) sólo medial al hueso cigomático (flecha negra) e inferior al globo. (B) Producción de desgarro de la glándula lagrimal superior palpebral (PSLG). Fotos de lapso de tiempo tomadas después de la aplicación tópica de 2% fluoresceína. El líquido acuoso que emana del PSLG diluye el tinte de fluoresceína negro o azul oscuro que lo convierte en verde amarillo brillante (similar a las pruebas de Seidel). (C) Posición de SLG orbital (OSLG) en el cráneo del conejo, acostado cerca de la línea media del cráneo (línea de puntos) dentro de la incisión posterior (flecha). El tinte azul de Evans se inyectó en la glándula lagrimal superior de OSLG y palpebral. (D) Sección histológica a través del conducto excretor principal del OSLG rodeado por una pequeña cantidad de tejido glandular (flecha) se ve en esta sección transversal histopatológica teñida con hematoxilina y distees de eosina tomados a través del aspecto posterior (temporal) del párpado superior derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Preparación del sitio quirúrgico. (A) Panel superior izquierdo: Eliminación de pelaje largo con tijeras. Todo el pelaje fino residual se elimina posteriormente con una crema depilatoria suave. Panel superior derecho: Aspecto final después de la extracción completa de la piel que permite realizar el marcado quirúrgico y el ultrasonido de alta calidad del ILG. (B) Se muestran las marcas quirúrgicas adecuadas de la región periorbital derecha; en este ejemplo, las incisiones para eliminar el OSLG y el ILG se han conectado para crear una incisión curvilínea larga. La ubicación de la incisión posterior se indica mediante una pequeña marca hash en la marca de sitio de incisión curvilínea (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Eliminación del OSLG. (A) Los sitios quirúrgicos se infiltran con anestésico utilizando una combinación de 50:50 de lidocaína al 2% con 1:100.000 epinefrina y 0,5% de bupivacaína, que se inyecta en el párpado superior y a lo largo de las líneas de incisión para minimizar el malestar durante el procedimiento. (B) Se utiliza una aguja de microdisección de Colorado para incisor la piel y las capas musculares superficiales a lo largo de los sitios de incisión quirúrgica marcados previamente. Se aplica una tracción suave a través de la herida para ayudar a crear el plano de disección. Las pequeñas quemaduras puntuales (flecha) se hicieron con la aguja de Colorado en puntos equidistantes a lo largo de la línea de incisión para ayudar a realinear óptimamente los tejidos durante el cierre de la herida. (C) El OSLG se expone después de que se hayan movilizado los tejidos que sobreloquen la incisión posterior (flecha). La cápsula de la glándula ha sido incisa. El OSLG se puede prolapsar aplicando presión medial al mundo facilitando su eliminación. (D) Los fórceps se utilizan para enganchar el OSLG y retirarlo suavemente de su posición más profunda dentro de la órbita a través de la incisión posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Extirpación de la glándula lagrimal superior palpebral (PSLG) y conducto excretor. (A) Después de la eversión del párpado superior, la parte bulbosa del PSLG se activa con fórceps y se disecciona fuera del tarso usando tijeras. La tracción aplicada al PSLG con fórceps es fundamental para mantener el plano quirúrgico. (B) La disección del PSLG y del conducto lagrimal principal se lleva superiormente hacia el borde orbital utilizando disección aguda y tracción continua en la glándula y los tejidos de los conductos para mantener el plano quirúrgico adecuado. La disección debe proceder al punto donde se eliminó el OSLG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Eliminación del ILG. (A) La piel y el músculo superficial se inciden hasta que se alcanza el plano fascial que cubre el hueso cigomático o la parte superficial del músculo maseter. La cabeza del ILG por lo general es claramente evidente como una pequeña protuberancia situada bajo el limbo anterior. (B) La cápsula fibrosa del ILG está incisada con tijeras que exponen el ILG. Una vez que la cápsula está incisa, las porciones más profundas de la glándula se pueden eliminar fácilmente. (C) La porción más externa de la cabeza de ILG que se encuentra en el hueso cigomático ha sido expuesta y reflejada anteriormente mostrando el hueso cigomático subyacente. (D) La incisión del tabique orbital a lo largo del borde inferior expone la cola del ILG. (E) Una rama de la arteria carótida externa alimenta la cola del ILG (flecha). (F) Apariencia tras el cierre de las incisiones cutáneas después de una dacryoadenectomía completa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Tinción de Bengala Rosa de la superficie corneal. Fotografía externa que muestra una tinción prominente, más notable en el cuadrante nasal. Todos los ojos sometidos a una dacrioadenectomía completa desarrollaron cambios similares que fueron evidentes a la 1 semana después de la cirugía y persistieron durante al menos 6 semanas. Cabe destacar que el reflejo de luz del destello del anillo muestra distorsión de una superficie ocular seca que demuestra cómo el ojo seco puede afectar negativamente la visión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Dacryoadenectomía media: SEM; n 16 ojos Base Semana 2 Tiempo de ruptura de desgarro, s 60,0 a 0,0 4,5 x 1,2 p < 0.0001 Osmolaridad lagrimal, mOsm 291,2 a 3,7 315,3 a 5,5 p á 0,001 Prueba de desgarro de Schirmer, mm 18,3 a 1,3 10,5 x 1,6 p á 0.0006 Rose bengal, puntuación NEI modificada 0,0 a 0,0 4,28 á 0,6 p < 0.0001 Operado vs. Línea de base: Dacryoadenectomía: TBUT, p < 0.0001; osmolaridad lagrimal, p < 0.001; Prueba de desgarro de Schirmer, p < 0.0006); y bengala rosa. Tabla 1: Parámetros del ojo seco en la semana postoperatoria 2.

Discussion

DED se clasifica en dos grupos principales basados en el efecto sobre la estabilidad de la película lagrimal: deficiente acuoso (disminución de la producción del componente acuoso de la película lagrimal; 20 % de DED) y evaporativo (evaporación aumentada de la película lagrimal; 50% de DED). Alrededor del 30% de los pacientes con DED muestran evidencia de ambos (DED mixto). La inflamación es el mecanismo central de DED al que convergen sus diversas etiologías13,14. Nuestro método modela DED acuoso-deficiente.

Como se mencionó anteriormente, los primeros pasos importantes en la reproducción de nuestro método son una apreciación de los puntos finos de la anatomía de las glándulas lagrimales orbitales (AG) del conejo y evitar la confusión mediante terminología anatómica variada y a veces conflictiva. El atlas anatómico de Popesko et al.11 es extremadamente minucioso. Para aquellos menos cómodos con la anatomía del conejo, la disección de especímenes de necropsia proporciona una fácil familiaridad con estas estructuras y ayuda a su extracción quirúrgica en especímenes vivos.

En nuestra publicacióncomplementaria 12se han dado consejos críticos sobre alojamiento y aclimatación de animales. El mismo artículo también presenta comentarios útiles para agregar los parámetros de DED utilizados en ambos métodos.

En contraste con el método anterior12, este requiere un mayor nivel de habilidad quirúrgica debido a la extensión y naturaleza más invasiva de las técnicas necesarias para eliminar los LGs. El mayor riesgo durante estas resecciones es el sangrado catastrófico causado por la lesión de los vasos principales que están muy cerca de los LC, como las ramas de la arteria carótida. Esto se evita visualizando adecuadamente cada LG y sus márgenes dentro del campo quirúrgico. Finalmente, la extirpación excesiva de la membrana nictiladora podría conducir al prolapso de la glándula harderiana, que puede interrumpir la evaluación de la película lagrimal.

Se debe tener cuidado de minimizar la cantidad de interrupción conjuntival con la eliminación del PSLG, un aspecto novedoso de nuestro método que mejora la reproducibilidad y mejora la gravedad de la DED. Es sorprendentemente fácil establecer el plano de disección y llevarlo de vuelta a la cresta orbital superior, siempre y cuando se aplique tracción a los tejidos. Es tranquilizador poder ver las marcas de cauterides del truncamiento del OSLG; confirman la extracción completa del conducto excretor principal de la glándula.

La eliminación del ILG en su totalidad también presenta desafíos. Aísle primero la cabeza de la glándula, ya que esta es la parte más fácil de visualizar. Toda la cabeza del tejido de la glándula se separa fácilmente de los tejidos circundantes; sin embargo, se debe tener cierto cuidado para evitar daños en el seno venoso grande, que se encuentra medial a la cabeza del ILG. La cola del ILG se puede seguir de nuevo a medida que pasa por debajo del hueso cigomático. La mayor parte de la cola es fácil de aislar. Sin embargo, el aspecto más posterior de la cola puede resultar más desafiante debido a la anatomía variable y su proximidad a una rama de tamaño medio de la carótida. La disección cuidadosa debe permitir que todos los márgenes del ILG se ven claramente, facilitando su eliminación completa. El investigador debe estar preparado para llevar la disección de manera más superior en los casos en que la cola de la glándula termina bajo el canthus lateral, como se explicó en la discusión anterior de la anatomía de las glándulas lagrimales. Cabe destacar que los autores nunca han sido capaces de identificar ninguna parte del OSLG al diseccione el ILG a través de una incisión curvilínea a lo largo del globo temporal e inferior. Aunque esto puede ser técnicamente posible, ese enfoque quirúrgico conlleva un riesgo demasiado alto de sangrado grave. Acercarse al OSLG a través de la incisión posterior resulta mucho más seguro.

El conducto excretor del ILG se puede ver penetrando a través del plano fascial inferior a medida que pasa al fornix conjuntival inferior. Ocasionalmente, pequeños lóbulos de tejido glandular que aparecen se ven aquí también y se pueden extirpar cuidadosamente.

Es muy útil mantener el orden de la resección LG como se presenta aquí. Si el ILG se elimina primero, el aislamiento del OSLG se vuelve técnicamente mucho más difícil. La razón principal es que, después de la eliminación del ILG, el OSLG no puede ser fácilmente prolapsado y por lo tanto identificado.

Una ventaja significativa de nuestro modelo es que puede ser “modular”. En otras palabras, el grado de DED inducido por la dacryoadenectomía se puede calibrar para satisfacer las necesidades experimentales. Por ejemplo, la resección de todos los LG causaría el máximo DED, pero la resección de sólo el SLG causaría la forma más leve de DED y la resección de sólo el ILG generaría enfermedad de gravedad intermedia.

Nuestro enfoque, que recapitula el evento fisiopatológico distinto de la producción reducida de lágrimas ofrece ventajas adicionales en comparación con los métodos ya reportados. Brevemente, ningún otro modelo quirúrgico eliminó la producción de lágrimas por todos los LGorbitales5,6,7,15,16; incluyendo la denervación parasimpática de los LT17,y la supresión farmacológica de la producción de lágrimas18,19, con estos dos últimos teniendo sus efectos fuera del objetivo como cofundadores significativos. Por último, este modelo minimiza el sesgo principal dependiente del investigador, a saber, la resección incompleta de los G.G,, ya que la técnica quirúrgica ofrece su visualización completa; esto se debe al hecho de que no se requiere hemostasia, aparte de la cautería.

El investigador debe ser consciente de que la resección completa de todos los NG orbitales no genera ausencia completa de lágrimas, y, por ejemplo, no se deben esperar los valores de prueba lagrimal de Schirmer que se acercan a cero. Esto se debe al hecho de que siempre hay otras fuentes de líquido lagrimal como los accesorios LGs de Wolfring y Krause y fugas de plasma de los vasos conjuntivales20,21,22. Desde un punto de vista experimental, esto debe ser visto como un aspecto positivo del método, ya que mantiene la superficie ocular; la xeroftalmia completa destruiría totalmente la córnea negando la utilidad del modelo. Además, en su realización actual, este modelo ofrece una excelente oportunidad para estudiar estos mecanismos compensatorios y el transporte de fluidos a través de estos compartimentos más pequeños.

En conclusión, aquí se presentan los detalles de un método novedoso y versátil de inducir DED acuoso-deficiente que se presta al estudio de la fisiología lagrimal, la patogénesis de DED y el estudio de los agentes terapéuticos que se están desarrollando para esta indicación.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconocemos el apoyo financiero de una subvención de Oportunidades de Investigación Dirigida de la Escuela de Medicina de la Universidad Stony Brook y una beca de investigación de Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Agradecemos a Michele McTernan por el apoyo editorial.

Materials

acepromazine, Aceproinj Henry Schein Animal Health, Dublin, OH NDC11695-0079-8 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation
anesthesia vaporizer VetEquip, Pleasanton, CA Item # 911103 Protocol 4.8
animal restraining bag Henry Schein Animal Health, Dublin, OH Jorvet J0170 Use appropriately sized bag.
bupivacaine, 0.5% Hospira Inc, Lake Forest IL NDC: 0409-1162-02 Mixed 50:50 with 2% lidocaine with 1:100,000 epinephrine for infiltration of incision sites, protocol 5.1
buprenorphine Henry Schein Animal Health, Dublin, OH 0.01 mg/kg, for postprocedural care, 6.1.4
cautery unit, high-temperature, battery-powered Medline Industries Inc, Northfield, IL REF ESCT001 Keep on hand in case of bleeding, protocol 2.7
clipper, Wahl Mini Arco Henry Schein Animal Health, Dublin, OH No. 022573 Cordless shears for fur removal, protocol 4.2
Colorado needle Stryker Craniomaxillofacial, Kalamazoo, MI N103A Use with electrosurgical unit to make incisions, protocol 5.1 & 5.3
electrosurgical unit with monopolar cautery plate Valleylab, Boulder, CO Force FXc Use with electrosurgical unit to make incisions, protocol 5.1 & 5.3
fluorescein, Ak-Fluor 10% AKRON, Lake Forest, IL NDC17478-253 Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
foceps, curved dressing Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ Storz E1406 delicate serrated dressing forceps
forceps, 0.3 Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ ET6319 For removal of nictating membrane, protocol 2.5
forceps, Bishop Harmon Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ E1500-C Use toothed forceps for dacryoadenectomy, protocol 5.1 & 5.2
hair remover lotion, Nair Widely available Softening Baby oil Dipilitory cream for sensitive skin, protocol 4.2
isoflurane Henry Schein Animal Health, Dublin, OH 29405 Possible alternative sedation, protocol 4.7
IV catheter, Terumo Surflo ETFE 24-gauge Terumo, Tokyo, Japan; available from Fisher Sci., VWR, McKesson, etc. SR-OX2419CA 25-gauge for smaller rabbits; protocol 4.6
ketamine Henry Schein Animal Health, Dublin, OH NDC 11695-0701-1; NADA 200-055 15 mg/kg, protocol 4.7
ketoprofen Hospira, Inc., Lake Forest, IL 3 mg/kg, for postprocedural care, 6.1.4
laryngeal mask airway Docsinnovent Ltd, London, UK Vgel R3 Protocol 4.8
lid speculum, wire Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ Barraquer SUH01 For removal of nictating membrane, protocol 2.4
lidocaine 2% with epinephrine 1:100,000; 50:50 mixture Hospira Inc, Lake Forest IL NDC 0409-3182-02 Pre-treat before removal of nictating membranes, protocol 2.4
lidocaine, preservative-free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO L5647 1% in PBS for anesthesia agent, for application to eye, protocol 2.4
micropipette Eppendorf Research Plus 100 uL For application of preservative-free lidocaine to eye, protocol 2.4
micropipette tips World Wide Medical Products 41071052 For application of preservative-free lidocaine to eye, protocol 2.4
monitoring device, multi-parameter SurgiVet, Waukesha, WI V9201 For monitoring of vitals, protocol 4.9
needle, 26-gauge BD, Franklin Lakes, NJ REF 305115 For injection of lidocaine/epinephrine, protocol 2.3 & 2.5
needle, 30-gauge BD, Franklin Lakes, NJ REF 305106 For infiltration of incision sites; syringe and needle size are not critical, protocol 5.1
osmolarity tips TearLab Corp., San Diego, CA #100003 REV R Measure tear osmolarity measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
osmometer, TearLab TearLab Corp., San Diego, CA Model#200000W REV A Measure tear osmolarity, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
povidone-iodine solution Medline Industries Inc, Northfield, IL PVP Prep Solution, NDC: 53329-939-04, REF MDS 093944 To maintain sterile field, protocol 4.11
rabbit, New Zealand White Charles River Labs, Waltham, MA (NZW) 2-3 kg Research animals
Rose bengal stain Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO NDC51801-004-40 1% in PBS, for staining the ocular surface, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
saline, normal B. Braun Medical, Irvine, CA REF R5200-01 For postprocedural care, protocol 6.1.3
Schirmer Tear Test strips Eaglevision, Katena products. Denville, NJ AX13613 Measure tear production, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
scissors, Vannas McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA Miltex 2-130 Capsulotomy scissors for dacryoadenectomy, protocol 5.1 & 5.2
scissors, Westcott tenotomy McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA Miltex 18-1480 For removal of nictating membrane, protocol 2.7
sedation gas mask DRE Veterinary, Louisville, KY #1381 Possible alternative sedation, protocol 4.7
surgical marking pen Medical Action Industries, Arden, ND REF 115 Protocol 4.2
sutures, 5-0 Mersilene Ethicon US, LLC Ethylene terephthalate sutures, used for deep connective tissue closure, protocol 5.3.11
sutures, Vicryl 6-0 Ethicon US, LLC Polyglactin 910 sutures, used for superficial muscle and skin closure, protocol 5.3.11
syringe, 1 cc BD, Franklin Lakes, NJ ref 309659 For injection of lidocaine/epinephrine, protocol 2.3 & 2.5
syringe, 5 cc BD, Franklin Lakes, NJ REF 309603 For infiltration of incision sites; syringe and needle size are not critical, protocol 5.1
tissue forceps, 0.8mm Graefe Roboz Surgical Store, Gaithersburg, MD RS-5150 Curved Weck forceps
topical antibiotic ointment (neomycin, polymyxin, bacitracin, and hydrocortisone) Bausch and Lomb, Tampa, FL NDC 24208-785-55 Applied after removal of nictating membrane, protocol 2.8, and for postprocedural care, protocol 6.1.2
ultrasound gel Parker Laboratories, Inc., Fairfield, NJ Aquasonic 100 To ensure electrical contact with monopolar cautery plate, protocol 4.5
xylazine Henry Schein Animal Health, Dublin, OH NADA: 139-236 1 mg/kg, protocol 4.7

References

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Cite This Article
Honkanen, R. A., Huang, L., Huang, W., Rigas, B. Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (155), e60126, doi:10.3791/60126 (2020).

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