Se presenta un enfoque novedoso para inducir la enfermedad crónica del ojo seco en los conejos mediante la extirpación quirúrgica de todas las glándulas lagrimales orbitales. Este método, distinto de los reportados anteriormente, produce un modelo estable y reproducible de ojo seco deficiente acuoso adecuado para estudiar fisiología lagrimal y fisiopatología y terapia ocular.
La enfermedad del ojo seco (DED) es una enfermedad compleja con múltiples etiologías y síntomas variables, que tiene la inflamación de la superficie ocular como su paso fisiopatológico clave. A pesar de los avances en nuestra comprensión de desenros, siguen existiendo importantes lagunas de conocimiento. Los avances son limitados en parte debido a la falta de modelos informativos de animales. Los autores informaron recientemente sobre un método de DED inducido por la inyección de todos los tejidos de la glándula lagrimal orbital (LG) con la lectina concanavalina A. Aquí, informamos de un modelo novedoso de DED deficiente acuoso basado en la resección quirúrgica de todos los tejidos orbitales LG (dacryoadenectomía). Ambos métodos utilizan conejos debido a su similitud con los ojos humanos en términos del tamaño y la estructura de la superficie ocular. Una semana después de la extracción de la membrana nictitando, el LG superior orbital fue extirpado quirúrgicamente bajo anestesia, seguido por la extirpación del LG superior palpebral, y finalmente la extirpación de la inferior LG. Dacryoadenectomía indujo DED severo, evidenciado por un marcada reducción en la prueba de tiempo de ruptura de desgarro y la prueba de desgarro de Schirmer, y aumentó significativamente la osmolaridad del desgarro y la tinción de bengala rosa. La DED inducida por Dacryoadenectomía duró al menos ocho semanas. No hubo complicaciones y los animales toleraron bien el procedimiento. La técnica puede ser dominada relativamente fácilmente por aquellos con experiencia quirúrgica adecuada y apreciación de la anatomía relevante del conejo. Dado que este modelo recapitula las características de la DED acosada por los acuosos humanos, es adecuado para estudios de homeostasis de superficie ocular, DED y terapias candidatas.
Las lágrimas son necesarias para la protección de la superficie ocular y para el mantenimiento de las propiedades ópticas de la córnea. Constan de tres capas: un recubrimiento de mucina interna, un componente acuoso medio y una superposición de lípidos1. La capa de mucina se produce predominantemente en las células de copa de la conjuntiva, el componente acuoso predominantemente en las glándulas lagrimales (LGs), y la capa lipídica predominantemente en las glándulas Meibomian1,2. Los GE orbitales son la fuente principal del componente acuoso de las lágrimas y de muchas de las proteínas que protegen la superficie del ataque bacteriano3. Las enfermedades de la superficie ocular se adecuen cuando la producción de lágrimas acuosas disminuye por debajo de un nivel crítico, privando a las superficies epiteliales del ojo del componente acuoso y a los componentes lagrimales cruciales, incluidos los factores de crecimiento, la lisozima y la lactoferrina. En los casos de disminución de la producción de lágrimas por los LGs, los tejidos conjuntival y corneal se someten a adaptaciones para compensar el ambiente alterado.
Comprender la contribución del componente lagrimal derivado de los LC orbitales y los mecanismos compensatorios de la superficie ocular cuando esto carece de impactos nuestra apreciación de la fisiología y fisiopatología del segmento anterior del ojo y, más ampliamente, de la salud y la enfermedad en todo el mundo. El enfoque experimental de estas cuestiones requiere un modelo animal informativo. En consecuencia, varios grupos han intentado desarrollar modelos animales en los que se eliminan los GLÚ orbitales, facilitando así la evaluación del papel de las lágrimas en la salud ocular. Uno de estos modelos fue reportado recientemente para el ratón4. El conejo ofrece, sin embargo, muchas ventajas distintas sobre los modelos de roedores, incluyendo estructuras anatómicas e histológicas similares de la LG, y tal vez lo más importante, tamaño similar y superficie de la córnea y los tejidos conjuntivales en comparación con sus homólogos humanos3.
La creación de enfermedad acuosa de ojo seco deficiente (DED) por resección quirúrgica del tejido LG en conejos no es nueva. Numerosos informes describen la resección de tejidos LG con un éxito variable reflejado en los cambios variables en la producción de lágrimas medidos por la prueba de desgarro de Schirmer5,6,7,8. Una comprensión profunda de la anatomía relevante del conejo y la claridad sobre la terminología anatómica son muy útiles en la reproducción de este método. A continuación se ofrece una visión general completa de ambos.
Anatomía de las glándulas lagrimales
El conejo tiene dos LG orbitales: el LG inferior más grande (ILG) y el superior más pequeño LG (SLG; Figura 1). El ILG se extiende a lo largo del aspecto inferior y posterior del borde orbital. Con la excepción del tamaño variable, la parte anterior del ILG tiene un aspecto bulboso bastante uniforme que puede ser visto como una protuberancia en la piel bajo el globo(Figura 2). Debido a su aspecto característico en relación con el resto de la glándula, se conoce como la “cabeza” del ILG. Una porción de la cabeza se envuelve y se encuentra en la superficie externa del hueso cigomático. Esto sirve como un punto de referencia útil en la biomicroscopía por ultrasonido para guiar las inyecciones en el ILG. El resto de la cabeza reside más mediamente9 en la órbita.
Debido a la apariencia característica de la parte restante del ILG, que es larga y delgada, este segmento se conoce como la “cola”. La cola corre a lo largo del borde orbital inferior, desde la cabeza del ILG hasta el borde orbital donde termina con anatomía variable en el borde orbital inferior y posterior(Figura 3A). La cola se encuentra profunda (medial) al hueso cigomático separado del contenido orbital por una banda fascial durante la mayor parte de su curso hasta que alcanza el borde posterior de la órbita donde se extiende una vez más sobre la superficie externa del hueso cigomático. El ILG recibe su suministro de sangre de las ramas de la arteria carótida.
El SLG tiene dos componentes análogos al humano. Uno es el LG superior palpebral (PSLG), que reside en el párpado posterior superior medial a la placa tarsal. Parece bulboso en la naturaleza y tiene numerosas aberturas punctadas que drenan el líquido lagrimal acuoso que se ve más fácilmente cuando se cubre con 2% de fluoresceína(Figura 3B).
El segundo es el SUPERIOR orbital LG (OSLG), que reside en una posición medial en la órbita superior(Figura 3C). Debido a su posición cerca de la línea media del cráneo, ha sido imposible identificarlo con éxito utilizando enfoques quirúrgicos externos de la órbita temporal o inferior. En muestras de necropsia fresca o casos quirúrgicos, esta glándula se puede propasar a través de la incisión posterior ubicada en la superficie dorsal del cráneo cuando se aplica una presión media suave al globo terráqueo. El prolapso de este tejido glandular se puede documentar con biomicroscopía por ultrasonido.
PsLG y OSLG son estructuras contiguas. El OSLG es una estructura tubuloalveolar cuya arquitectura ductal se une al conducto excretor principal. Este conducto pasa por debajo de la cresta supra-orbital y corre en los tejidos del párpado superior terminando en el PSLG. A lo largo del conducto excretor, se ha identificado el tejido glandular consistente con las descripciones originales de Davis10 (Figura 3D).
Una nota sobre terminología
Excelentes y completas descripciones anatómicas utilizan terminología variable, así. La anatomía orbital clásica de Davis define sólo un LG10superior e inferior. Sin embargo, su descripción del LG superior detalla claramente las partes más específicamente definidas aquí como el PSLG y OSLG, mientras que su descripción del LG inferior detalla las partes definidas aquí como la cabeza y la cola del ILG. Un atlas anatómico más reciente y completo11 define estos tejidos como la glándula cigomática y el accesorio LG. El término “glándula lagrimal” se utiliza aquí para comprender el mencionado PSLG y OSLG. Esta terminología es más adecuada para reproducir este método sin confusión indebida.
DED se clasifica en dos grupos principales basados en el efecto sobre la estabilidad de la película lagrimal: deficiente acuoso (disminución de la producción del componente acuoso de la película lagrimal; 20 % de DED) y evaporativo (evaporación aumentada de la película lagrimal; 50% de DED). Alrededor del 30% de los pacientes con DED muestran evidencia de ambos (DED mixto). La inflamación es el mecanismo central de DED al que convergen sus diversas etiologías13,14. Nuestro método modela DED acuoso-deficiente.
Como se mencionó anteriormente, los primeros pasos importantes en la reproducción de nuestro método son una apreciación de los puntos finos de la anatomía de las glándulas lagrimales orbitales (AG) del conejo y evitar la confusión mediante terminología anatómica variada y a veces conflictiva. El atlas anatómico de Popesko et al.11 es extremadamente minucioso. Para aquellos menos cómodos con la anatomía del conejo, la disección de especímenes de necropsia proporciona una fácil familiaridad con estas estructuras y ayuda a su extracción quirúrgica en especímenes vivos.
En nuestra publicacióncomplementaria 12se han dado consejos críticos sobre alojamiento y aclimatación de animales. El mismo artículo también presenta comentarios útiles para agregar los parámetros de DED utilizados en ambos métodos.
En contraste con el método anterior12, este requiere un mayor nivel de habilidad quirúrgica debido a la extensión y naturaleza más invasiva de las técnicas necesarias para eliminar los LGs. El mayor riesgo durante estas resecciones es el sangrado catastrófico causado por la lesión de los vasos principales que están muy cerca de los LC, como las ramas de la arteria carótida. Esto se evita visualizando adecuadamente cada LG y sus márgenes dentro del campo quirúrgico. Finalmente, la extirpación excesiva de la membrana nictiladora podría conducir al prolapso de la glándula harderiana, que puede interrumpir la evaluación de la película lagrimal.
Se debe tener cuidado de minimizar la cantidad de interrupción conjuntival con la eliminación del PSLG, un aspecto novedoso de nuestro método que mejora la reproducibilidad y mejora la gravedad de la DED. Es sorprendentemente fácil establecer el plano de disección y llevarlo de vuelta a la cresta orbital superior, siempre y cuando se aplique tracción a los tejidos. Es tranquilizador poder ver las marcas de cauterides del truncamiento del OSLG; confirman la extracción completa del conducto excretor principal de la glándula.
La eliminación del ILG en su totalidad también presenta desafíos. Aísle primero la cabeza de la glándula, ya que esta es la parte más fácil de visualizar. Toda la cabeza del tejido de la glándula se separa fácilmente de los tejidos circundantes; sin embargo, se debe tener cierto cuidado para evitar daños en el seno venoso grande, que se encuentra medial a la cabeza del ILG. La cola del ILG se puede seguir de nuevo a medida que pasa por debajo del hueso cigomático. La mayor parte de la cola es fácil de aislar. Sin embargo, el aspecto más posterior de la cola puede resultar más desafiante debido a la anatomía variable y su proximidad a una rama de tamaño medio de la carótida. La disección cuidadosa debe permitir que todos los márgenes del ILG se ven claramente, facilitando su eliminación completa. El investigador debe estar preparado para llevar la disección de manera más superior en los casos en que la cola de la glándula termina bajo el canthus lateral, como se explicó en la discusión anterior de la anatomía de las glándulas lagrimales. Cabe destacar que los autores nunca han sido capaces de identificar ninguna parte del OSLG al diseccione el ILG a través de una incisión curvilínea a lo largo del globo temporal e inferior. Aunque esto puede ser técnicamente posible, ese enfoque quirúrgico conlleva un riesgo demasiado alto de sangrado grave. Acercarse al OSLG a través de la incisión posterior resulta mucho más seguro.
El conducto excretor del ILG se puede ver penetrando a través del plano fascial inferior a medida que pasa al fornix conjuntival inferior. Ocasionalmente, pequeños lóbulos de tejido glandular que aparecen se ven aquí también y se pueden extirpar cuidadosamente.
Es muy útil mantener el orden de la resección LG como se presenta aquí. Si el ILG se elimina primero, el aislamiento del OSLG se vuelve técnicamente mucho más difícil. La razón principal es que, después de la eliminación del ILG, el OSLG no puede ser fácilmente prolapsado y por lo tanto identificado.
Una ventaja significativa de nuestro modelo es que puede ser “modular”. En otras palabras, el grado de DED inducido por la dacryoadenectomía se puede calibrar para satisfacer las necesidades experimentales. Por ejemplo, la resección de todos los LG causaría el máximo DED, pero la resección de sólo el SLG causaría la forma más leve de DED y la resección de sólo el ILG generaría enfermedad de gravedad intermedia.
Nuestro enfoque, que recapitula el evento fisiopatológico distinto de la producción reducida de lágrimas ofrece ventajas adicionales en comparación con los métodos ya reportados. Brevemente, ningún otro modelo quirúrgico eliminó la producción de lágrimas por todos los LGorbitales5,6,7,15,16; incluyendo la denervación parasimpática de los LT17,y la supresión farmacológica de la producción de lágrimas18,19, con estos dos últimos teniendo sus efectos fuera del objetivo como cofundadores significativos. Por último, este modelo minimiza el sesgo principal dependiente del investigador, a saber, la resección incompleta de los G.G,, ya que la técnica quirúrgica ofrece su visualización completa; esto se debe al hecho de que no se requiere hemostasia, aparte de la cautería.
El investigador debe ser consciente de que la resección completa de todos los NG orbitales no genera ausencia completa de lágrimas, y, por ejemplo, no se deben esperar los valores de prueba lagrimal de Schirmer que se acercan a cero. Esto se debe al hecho de que siempre hay otras fuentes de líquido lagrimal como los accesorios LGs de Wolfring y Krause y fugas de plasma de los vasos conjuntivales20,21,22. Desde un punto de vista experimental, esto debe ser visto como un aspecto positivo del método, ya que mantiene la superficie ocular; la xeroftalmia completa destruiría totalmente la córnea negando la utilidad del modelo. Además, en su realización actual, este modelo ofrece una excelente oportunidad para estudiar estos mecanismos compensatorios y el transporte de fluidos a través de estos compartimentos más pequeños.
En conclusión, aquí se presentan los detalles de un método novedoso y versátil de inducir DED acuoso-deficiente que se presta al estudio de la fisiología lagrimal, la patogénesis de DED y el estudio de los agentes terapéuticos que se están desarrollando para esta indicación.
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos el apoyo financiero de una subvención de Oportunidades de Investigación Dirigida de la Escuela de Medicina de la Universidad Stony Brook y una beca de investigación de Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Agradecemos a Michele McTernan por el apoyo editorial.
acepromazine, Aceproinj | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation |
anesthesia vaporizer | VetEquip, Pleasanton, CA | Item # 911103 | Protocol 4.8 |
animal restraining bag | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | Jorvet J0170 | Use appropriately sized bag. |
bupivacaine, 0.5% | Hospira Inc, Lake Forest IL | NDC: 0409-1162-02 | Mixed 50:50 with 2% lidocaine with 1:100,000 epinephrine for infiltration of incision sites, protocol 5.1 |
buprenorphine | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | 0.01 mg/kg, for postprocedural care, 6.1.4 | |
cautery unit, high-temperature, battery-powered | Medline Industries Inc, Northfield, IL | REF ESCT001 | Keep on hand in case of bleeding, protocol 2.7 |
clipper, Wahl Mini Arco | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | No. 022573 | Cordless shears for fur removal, protocol 4.2 |
Colorado needle | Stryker Craniomaxillofacial, Kalamazoo, MI | N103A | Use with electrosurgical unit to make incisions, protocol 5.1 & 5.3 |
electrosurgical unit with monopolar cautery plate | Valleylab, Boulder, CO | Force FXc | Use with electrosurgical unit to make incisions, protocol 5.1 & 5.3 |
fluorescein, Ak-Fluor 10% | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1 |
foceps, curved dressing | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | Storz E1406 | delicate serrated dressing forceps |
forceps, 0.3 | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | ET6319 | For removal of nictating membrane, protocol 2.5 |
forceps, Bishop Harmon | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | Use toothed forceps for dacryoadenectomy, protocol 5.1 & 5.2 |
hair remover lotion, Nair | Widely available | Softening Baby oil | Dipilitory cream for sensitive skin, protocol 4.2 |
isoflurane | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | 29405 | Possible alternative sedation, protocol 4.7 |
IV catheter, Terumo Surflo ETFE 24-gauge | Terumo, Tokyo, Japan; available from Fisher Sci., VWR, McKesson, etc. | SR-OX2419CA | 25-gauge for smaller rabbits; protocol 4.6 |
ketamine | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC 11695-0701-1; NADA 200-055 | 15 mg/kg, protocol 4.7 |
ketoprofen | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | 3 mg/kg, for postprocedural care, 6.1.4 | |
laryngeal mask airway | Docsinnovent Ltd, London, UK | Vgel R3 | Protocol 4.8 |
lid speculum, wire | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | Barraquer SUH01 | For removal of nictating membrane, protocol 2.4 |
lidocaine 2% with epinephrine 1:100,000; 50:50 mixture | Hospira Inc, Lake Forest IL | NDC 0409-3182-02 | Pre-treat before removal of nictating membranes, protocol 2.4 |
lidocaine, preservative-free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | L5647 | 1% in PBS for anesthesia agent, for application to eye, protocol 2.4 |
micropipette | Eppendorf | Research Plus 100 uL | For application of preservative-free lidocaine to eye, protocol 2.4 |
micropipette tips | World Wide Medical Products | 41071052 | For application of preservative-free lidocaine to eye, protocol 2.4 |
monitoring device, multi-parameter | SurgiVet, Waukesha, WI | V9201 | For monitoring of vitals, protocol 4.9 |
needle, 26-gauge | BD, Franklin Lakes, NJ | REF 305115 | For injection of lidocaine/epinephrine, protocol 2.3 & 2.5 |
needle, 30-gauge | BD, Franklin Lakes, NJ | REF 305106 | For infiltration of incision sites; syringe and needle size are not critical, protocol 5.1 |
osmolarity tips | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | Measure tear osmolarity measurement of dry eye parameters, protocol 3.1 |
osmometer, TearLab | TearLab Corp., San Diego, CA | Model#200000W REV A | Measure tear osmolarity, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1 |
povidone-iodine solution | Medline Industries Inc, Northfield, IL | PVP Prep Solution, NDC: 53329-939-04, REF MDS 093944 | To maintain sterile field, protocol 4.11 |
rabbit, New Zealand White | Charles River Labs, Waltham, MA (NZW) | 2-3 kg | Research animals |
Rose bengal stain | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 1% in PBS, for staining the ocular surface, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1 |
saline, normal | B. Braun Medical, Irvine, CA | REF R5200-01 | For postprocedural care, protocol 6.1.3 |
Schirmer Tear Test strips | Eaglevision, Katena products. Denville, NJ | AX13613 | Measure tear production, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1 |
scissors, Vannas | McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA | Miltex 2-130 | Capsulotomy scissors for dacryoadenectomy, protocol 5.1 & 5.2 |
scissors, Westcott tenotomy | McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA | Miltex 18-1480 | For removal of nictating membrane, protocol 2.7 |
sedation gas mask | DRE Veterinary, Louisville, KY | #1381 | Possible alternative sedation, protocol 4.7 |
surgical marking pen | Medical Action Industries, Arden, ND | REF 115 | Protocol 4.2 |
sutures, 5-0 Mersilene | Ethicon US, LLC | Ethylene terephthalate sutures, used for deep connective tissue closure, protocol 5.3.11 | |
sutures, Vicryl 6-0 | Ethicon US, LLC | Polyglactin 910 sutures, used for superficial muscle and skin closure, protocol 5.3.11 | |
syringe, 1 cc | BD, Franklin Lakes, NJ | ref 309659 | For injection of lidocaine/epinephrine, protocol 2.3 & 2.5 |
syringe, 5 cc | BD, Franklin Lakes, NJ | REF 309603 | For infiltration of incision sites; syringe and needle size are not critical, protocol 5.1 |
tissue forceps, 0.8mm Graefe | Roboz Surgical Store, Gaithersburg, MD | RS-5150 | Curved Weck forceps |
topical antibiotic ointment (neomycin, polymyxin, bacitracin, and hydrocortisone) | Bausch and Lomb, Tampa, FL | NDC 24208-785-55 | Applied after removal of nictating membrane, protocol 2.8, and for postprocedural care, protocol 6.1.2 |
ultrasound gel | Parker Laboratories, Inc., Fairfield, NJ | Aquasonic 100 | To ensure electrical contact with monopolar cautery plate, protocol 4.5 |
xylazine | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NADA: 139-236 | 1 mg/kg, protocol 4.7 |