ウサギにおける完全なダクリオアデネクトー切除術を用いた重症ドライアイモデルの確立

すべての脊椎動物の動物研究は、すべての関連する規制および制度ガイドラインに従って完了しました。すべての研究は、ストーニーブルック大学の機関審査委員会によって承認され、眼科および視覚研究における動物の使用のための視覚眼科学研究協会(ARVO)声明に従って行われました。 1. 動物・住宅 2−3 kgのニュージーランドホワイト(NZW)ウサギを使用してください。 厳密に管理された環境で個別にウサギを収容する:温度(65 ±5 °F)、湿度(45 ±5%)、照明(12時間オン/オフサイクル)。注:グループハウスであるウサギの間でしばしば示される攻撃的な行動のために、不注意な眼の傷害を防ぐために個々のケージに動物を保ちます。 ウサギは、標準的なウサギのチョウと水への無制限のアクセスを与えます。 ドライアイに影響を与える可能性のある不注意なビタミンA補給を防ぐために、他の食事濃縮を提供しません。 DEDパラメータを記録する前に少なくとも2週間の慣性ウサギ。 2. ニチタチブ膜の除去 注:わかりやすくするために、右目のテクニックを以下に説明します。左目のこの手順を同じ方法で実行します。 順応期間中(通常は最初の週)に両側にニチカチ膜を取り除きます。 ウサギを適当な大きさの拘束袋に入れます。 1ccシリンジと26G針を使用して肩にアセプロマジン(1mg/kg)の皮下注射を投与し、ウサギを鎮静させる。この穏やかな沈下の終点は、動物が正常な走査運動なしでリラックスした頭部位置を維持し、その耳が完全に直立していない場合である。 マイクロピペットを使用して、防腐剤フリーリドカインの25°Lを適用する(1%)目に。まぶたの間にワイヤー蓋の鏡を挿入します。 頂点のニチタチカチ膜を0.3鉗子(または同等)で把握し、角膜表面上に引っ張ります。1%リドカインに1:100,000エピネフリンを注入し、26G針を用いてニチッティング膜の結膜下膜に挿入する。約0.3mLを注入して、ニチタリング膜の上に控えめなサイズのブレブを形成します。1 mL 以上の注射量は、ウサギの安全な用量範囲内 (2-4 mg/kg) です。 ワイヤスペクトルを取り外します。リドカインとエピネフリンが有効になるまで約5分間待ちます。この間、仲間の目で同じ手順を実行します。 ワイヤーふたの鏡を交換してください。0.3鉗子を使用して角膜表面上のニチタリング膜をつかみ、伸ばします。膜をその基部で、解膜はさみまたは同等のもので切断します。メモ:通常、出血は最小限ですが、高温のバッテリー焼灼ユニットを近くに保管し、必要に応じて使用して出血を最小限に抑えます。ニチタチ膜の切断ベース上の直接圧力は、それが発生した場合に小さな出血を止めるために使用することができます。 ワイヤーふたの鏡を取り外します。角膜表面に局所抗生物質軟膏(ネオマイシン、ポリミキシン、バチトラシン、ヒドロコルチゾン)を置きます。 プロトコルで示されているように、仲間の目と同じ手順を実行します。 動物を個々のケージに戻し、少なくとも1週間、または結膜表面が臨床的な観点から完全に治癒するまで、さらなるアッセイまたは介入を行う前に、動物を治癒させる。注:完全な臨床治癒は、結膜表面からの腫脹、注射または排出の欠如によって示される。動物は保護性の下手を持たずに、目を正常に開けておくべきである。 3. ドライアイパラメータの測定と涙液サンプルの採取 実験プロトコルに応じて、次のDEDパラメータを測定します:涙浸透圧、涙分解時間、シルマーの涙液試験、およびローズベンガル染色。少なくとも2人の調査員のチームで、前述の12のようにそれらを実行します。注:少なくとも2人の調査者のチームは、同じクロック時間の周りに動物のより大きなグループ(6以上)の効率的な測定を可能にし、結果に影響を与える可能性のある概日変動を防ぐことができます。 4. 外科的準備と麻酔 上記のように皮下アセプロマジン(1mg/kg)で拘束袋に入れた動物を軽く沈静化させる。 外科的ランドマークを視覚化するために、頭蓋骨の顔と後ろ面上のすべての毛皮を削除します。 長さ約1mmの残留微細ファーを残した切断せん断で毛皮をトリムします(図4A、左)。 製造元の指示に従って、軽度の脱毛クリームを使用してすべての残留ファーを取り除きます(図4A、右)。 手術用ペンで外科的切開部位をマークします。 OSLGの脱出から後部の発裂の上に皮膚に小さな膨らみが発生する原因となる内側の切圧を地球に適用することによって、後部の切開部位を特定する。 外科マーキングペンで頭蓋骨の背中の表面の上の皮膚の前/後方向に直線的な2cmのマークを作ります。 ILGの除去のための切開を計画する場合、眼の周りに長い曲線線(下側および側頭蓋のマージンから1cm)を前軌道(中間)に延びるマークを付ける。マーキングを後軌道に沿って内側の軌道に沿って内側のカンサスのレベルまで延ばすか、これより優れているようにします(図4B)。一部のディスセクションでは、OSLGとILGを除去するための切開が接続されます。注:二国間手術を行う場合は、この時点で両方の軌道に印を付けます。 各大腿の側面にせん断をかけて幅2~3cmの毛皮のパッチをトリムし、単極焼灼板を配置できるようにします。 超音波ゲルを適用して、単極焼灼板との良好な電気的接触を確保します。 必要に応じて、耳の限界静脈の1つに25G静脈内(IV)カテーテルを置き、薬物または液体を投与する。 皮下キシラジン(1mg/kg)とIVケタミン(15 mg/kg)を麻酔の初期誘導(IVアクセスを介して)を与える。注:ウサギがステップ2.3で説明したエンドポイントを保持するのに十分なアセプロマジンで事前に鎮静されている場合は、代わりにアイソフルランでガスマスク鎮静を使用してください。 弾性バンドまたは弦を使用して、喉頭マスク気道を所定の場所に配置し、気道を固定および維持します。 1 L/分に設定された酸素流量でマスクを麻酔機に接続します。 イソフルランを最初に5%に設定し、動物の沈み込みのレベルに基づいて許容されるほど減らします。 最終的な創傷閉鎖まで2%以上でアイソフルランを維持する。注:外科的または痛みを伴う刺激に応答して呼吸数と動きを監視することにより、沈下のレベルを評価します。呼吸数が毎分10回以上増加した場合、ウサギが気道維持装置で噛み始めた場合、または痛みを伴う刺激に反応して何らかの動きが観察される場合は、麻酔の深さを増加させる。 多パラメータ監視装置または他の適切な装置を使用して、パルスオキシメトリー、カプノグラフィー、血圧、直腸体温および心拍数を監視する。 処置の間に連続的に生命を監視し、10から15分ごとに記録する。 低体温を防ぐために、手術室(OR)テーブルの上にウサギを暖房パッドの上に置きます。出血を最小限に抑えるために、約30°で逆トレンデレンブルクの位置にテーブルを傾けます。 滅菌場を維持するために、滅菌水とドレープで半分強度に希釈したポビドネヨウ素溶液で手術領域を準備します。 5. 完全な外科的ダクリオアデネクトー切り 注:本明細書に記載されているように、完全な外科的ダクリオアデネクトーミーは、0.3組織鉗子、歯切りはさみ、歯のない組織鉗子およびはさみを用いて行われた。これらの器械は外科医の好みに基づいて同じ機能を行う同様の器械と交換することができる。 最初に OSLG を取り外します。 切開部位(外科マーキングペンラインと上後蓋)に、2%リドカインと1:100,000エピネフリン、0.5%ブピバカインを30G針で5ccシリンジを用いて50:50混合物で浸潤部位(図5A)に浸潤する(図5A)。メモ:注射器と針のサイズは重要ではありません。 電気手術ユニットに接続されたコロラド針を使用して、外科的マーキングに沿って皮膚切開を行います。設定は臨床応答に基づいて異なり、通常は切断と凝固の両方で10〜15単位の間です(図5B)。 皮膚切開部全体に反対の緊張を加えて組織を分離し、下層前頭角筋線維を露出させる。 前頭角筋線維の内側または深さに位置する膨らんだ組織として見られるOSLGの可視化を支援するために、地球上の内側圧を適用します。必要に応じて、これらの筋線維を側面に移動して、基礎となるインシストを公開します。 歯付き鉗子(0.3)とカプロートミーハサミで、OSLGの上に上にある繊維状のカプセルをやさしく引き込み、切断します。OSLGは通常、淡い日焼け色をしています(図5C)。 歯付きまたは歯のない鉗子を使用して、OSLG腺組織をつかみ、「手渡し」技術を使用して優れた熱心な介動を通してそれを引き出します。カプロートミーはさみを使って小さな繊維状バンドをカットし、軌道上のその位置から腺を解放します(図5D)。注:OSLG腺組織が除去されると、それは大きなチューブ状の構造(主な排泄管)に合体し始めます。 腺が可能な限り完全に除去されたら、コロラド針で寛大な焼灼を使用して組織のチャールを作成し、可能な限り深く内側の亀頭の中で腺を切り捨てる。これは後にPSLGの除去中に確認ランドマークとして機能します. PSLG を削除します。 綿の先端のアプリケーターを使用して上まぶたをエフォートします。PSLGの球根端は通常容易に見える。注:一部の解剖学的解剖では、主排泄管を幅約1または2mmの淡い線形構造として可視化することができる場合がある。 PSLGを歯付き鉗子(0.3)で係合し、カプロートミーはさみを使用して基底から歯根を分離するベースを切断しながら、まぶたの表面から引き込みます(図6A)。 単極焼灼で中等度の出血を制御する。 分離された組織に連続的な牽引を適用して解剖のための組織面を維持する。これにより、SLGの主要な排泄管も取り除くことを可能にします(図6B)。注:解剖が行われるように、それは通常、より優れた、中間的に位置するOSLGの除去から残された焼灼マークを見することができる上軌道リムに進みます。 ILG を切除します。 局所麻酔薬が有効になるまで少なくとも5分間待ちます。 皮膚を切開し、下手根のうつ病筋、頬骨筋の頬骨室下部、およびコロラドマイクロセクション針を用いた口内筋と、セクション5.1のOSLGに対して分離する。 単極焼灼で止血を維持する。 切開は皮膚のマーキングを通して深く運ばれるので、マセッター筋肉の頬骨または表面的な部分の上に面膜の光沢を探します。この時点で、組織面を維持し、コロラド針を使用して軌道リムに向かって優れた搬下を行います(図7A)。メモ:ILGを識別する目的で、通常は眼の前肢よりも劣るILGの頭部の上に解剖のこの部分を実行するのが最も簡単です。 ILGを取り囲むカプセルを同定して切開した後、ILGの日焼け組織を同定する。ILG ヘッドの前部のみが表示されます (図 7B)。ただし、頭部は、頬骨アーチの下を通過し、尾部に遷移する中間に従うことができる(図7C)。 腸切りはさみを使用して、ILGテールのより後部を露出させる下縁に沿って眼窩中隔を切断します。組織面が特定されたら、切開線全体に沿って解剖を後部に延長する(図7D)。注:ILGのダクトは、蓋の側頭部の下側結膜空間に入るために、下部線維結合組織を通過します。後部リムでは、ILGの尾部は様々な解剖学的構成を有することができる。時には後部(横)缶に劣って終わることがあり、他のセクションでは時間軌道の周りにより優越して延びる。 ILGが頸動脈の枝から受け取る血液供給への不注意な損傷を防ぐために細心の注意を払う。血液供給は解剖のこの部分の間に見ることができます (図 7E) 。 尾が後部(横)の下で終発する場合、頬骨に沿って位置するILGの尾部を露出させるために、前皮筋の側頭部分を二分する必要がある場合がある。 ILG 全体が分離され、公開されたら、削除します。サイズが大きいため、はさみで半分に切り、尾から離して頭部を取り除くことが好ましいことが多い。 ILGの頭部を取り外すときは、軌道上の大きな静脈の静脈にすぐ隣接しているので、非常に慎重に進んでください。外科的切除中にこの構造からの出血は起こっていないが、このリスクを軽減するために十分な止血補助具が存在する。 すべての腺組織を除去した後、複数の中断された5-0エチレンテレフタル酸縫合糸で深い結合組織面を閉じます。0.3組織鉗子と針ドライバーを使用して、6-0ポリラクチン910縫合糸(図7F)を実行して表面的な筋肉と皮膚を閉じます。 6. 手続き後のケア 動物を解凍し、滅菌水で手術部位を浄化します。 切開部に局所眼科用抗生物質とステロイド軟膏(ネオマイシン、ポリミキシン、バシトラシン、ヒドロコルチゾン)を塗布する。このアプリケーションを 1 日 2 回 2 日間継続します。 26 G針を使用して、肩甲骨の上に20 mLの正常な生理行物の皮下注射を与えます。 皮下ブプレノルフィン0.01 mg/kgまたはケトプロフェン3 mg/kgを与え、1ccの注射器と30 G針を使用して疼痛制御を行う。注:動物は1-2日以内に通常の食事摂取量と活動に戻る必要があります。ウサギは、進行性の腫脹、痛み、紅斑、カロリーまたは化膿性分泌物によって示されるように、感染の臨床徴候について少なくとも毎週評価されるべきである。動物はまた、切開部位/縫合線を傷つけ始めないように観察する必要があります。ダクリオアデネクトーシス切除前にすべての爪をトリミングすることは、この点で役立つかもしれません。切開線の引っ掻き傷が見られる場合は、自傷行為を防ぐために標準的な保護首輪が使用される。 麻酔を逆にします。 動物が刺激に反応し、自発的な噛み付きが現れ始めた後、気道メンテナが損傷する前に気道維持装置を取り外します。 およそ1−2時間、またはケージ内の自発的な動きによって示されるように麻酔から完全に回復するまで、動物を監視する。 動物の痛みを評価し、適切に治療します。 DEDの臨床対策を行う前に、手術後少なくとも1週間は動物を回復させてください。