Établissement d'un modèle d'oeil sec grave utilisant la Dacryoadenectomy complète dans des lapins

Toutes les études sur les animaux vertébrés ont été réalisées conformément à toutes les lignes directrices réglementaires et institutionnelles pertinentes. Toutes les études ont été approuvées par la Commission d’examen institutionnel de l’Université Stony Brook et réalisées conformément à l’énoncé de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) sur l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. 1. Animaux et logement Utilisez des lapins blancs néo-zélandais (NZW) pesant 2 à 3 kg. Loger les lapins individuellement dans un environnement strictement contrôlé : température (65 ‘5 ‘F), humidité (45 ‘ 5%), et éclairage (12 h sur/hors cycle).REMARQUE : En raison de comportements agressifs souvent exposés entre les lapins qui sont logés en groupe, gardez les animaux dans des cages individuelles pour prévenir les blessures oculaires par inadvertance. Donnez aux lapins un accès illimité à la chow et à l’eau de lapin standard. Ne fournissez aucun autre enrichissement diététique de façon à empêcher la supplémentation par inadvertance de vitamine A qui pourrait affecter l’oeil sec. Acclimater les lapins au moins deux semaines avant d’enregistrer les paramètres DED. 2. Enlèvement de la membrane nictitating REMARQUE: Pour la simplicité, la technique pour l’œil droit est décrite ci-dessous. Terminer cette procédure sur l’œil gauche d’une manière identique. Enlever la membrane nictitating bilatéralement pendant la période d’acclimatation (généralement la première semaine). Placer le lapin dans un sac de retenue de taille appropriée. Administrer une injection sous-cutanée d’acépromazine (1 mg/kg) sur les épaules à l’aide d’une seringue de 1 cc et d’une aiguille de 26 G pour calmer le lapin. Le point d’évaluation de cette sédation légère est lorsque l’animal maintient une position de tête détendue sans mouvements de balayage normaux et ses oreilles ne sont plus entièrement debout. À l’aide d’une micropipette, appliquer 25 llidocaïnes sans agent de conservation (1 %) à l’œil. Insérez un spéculum de couvercle de fil entre les paupières. Saisissez la membrane nictitating à son sommet avec 0.3 forceps (ou équivalent) et tirez-la au-dessus de la surface cornéenne. Injecter 1 % de lidocaïne avec 1:100 000 épinéphrine dans l’espace subconjonctivale de la membrane nictitating à l’aide d’une aiguille de 26 G. Injecter environ 0,3 ml pour former une tache de taille modeste sur la membrane nictitating. Les volumes d’injection de plus de 1 ml sont bien dans une fourchette de dose sûre pour les lapins (2 à 4 mg/kg). Retirez le spéculum de fil. Attendez environ 5 min pour que la lidocaïne et l’épinéphrine prennent effet. Pendant ce temps, effectuer la même procédure dans l’œil de l’autre. Remplacer le spéculum du couvercle métallique. Saisir et étendre la membrane nictitating sur la surface cornéenne à l’aide de 0,3 forceps. Couper la membrane à sa base avec des ciseaux à tenotomie ou équivalent.REMARQUE : Les saignements sont habituellement minimes, mais gardez une unité de cautérisation à haute température à proximité et utilisez-la au besoin pour minimiser les saignements. La pression directe au-dessus de la base de coupe de la membrane nictitating peut également être employée pour arrêter de petits saignements s’il se produit. Retirez le spéculum du couvercle métallique. Placez l’onguent antibiotique topique (néomycine, polymyxine, bacitracin, et hydrocortisone) au-dessus de la surface cornéenne. Effectuer une procédure identique à l’œil de l’autre comme indiqué par le protocole. Placez les animaux dans des cages individuelles et laissez-les guérir pendant au moins une semaine, ou jusqu’à ce que la surface conjonctive ait guéri complètement d’un point de vue clinique, avant d’effectuer d’autres essais ou interventions.REMARQUE : La guérison clinique complète est indiquée par l’absence de tout gonflement, injection ou décharge des surfaces conjonctives. Les animaux doivent garder les yeux ouverts normalement, sans la présence de ptose protectrice. 3. Mesure des paramètres des yeux secs et collecte d’échantillons de déchirure Mesurez les paramètres DED suivants, le cas échéant au protocole expérimental : osmolarité lacrymale, temps de rupture de déchirure, test de déchirure de Schirmer, et coloration de bengal de rose. Exécutez-les comme décrit précédemment12, avec une équipe d’au moins deux enquêteurs.REMARQUE : Une équipe d’au moins deux chercheurs permet de mesurer efficacement de plus grands groupes d’animaux (6 ou plus) autour du même temps d’horloge empêchant ainsi la variation circadienne possible d’impacter des résultats. 4. Préparation chirurgicale et anesthésie Animaux légèrement sédatifs placés dans un sac de retenue avec acépromazine sous-cutanée comme ci-dessus (1 mg/kg). Enlever toute la fourrure sur le visage et la surface dorsale du crâne pour visualiser les repères chirurgicaux. Couper la fourrure avec des cisailles de coupe laissant la fourrure fine résiduelle d’environ 1 mm de longueur(figure 4A, à gauche). Retirer toute la fourrure résiduelle à l’aide d’une crème dépilatoire douce suivant les instructions du fabricant (Figure 4A, droite). Marquez les emplacements chirurgicaux d’incision avec un stylo chirurgical. Identifiez le site d’incision au-dessus de l’incisure postérieure en appliquant la pression médiale au globe causant un petit renflement pour se développer dans la peau au-dessus de l’incisure postérieure du prolapsus de l’OSLG. Faire une marque linéaire de 2 cm dans la direction antérieure/postérieure sur la peau au-dessus de la surface dorsal du crâne directement au-dessus de ce site avec un stylo de marquage chirurgical. Lors de la planification de l’incision pour l’élimination de l’ILG, marquez une longue ligne curviligne autour de l’œil (1 cm de la marge inférieure et temporelle du couvercle) s’étendant de l’orbite postérieure (temporelle) au canthus antérieur (médial). Faire le marquage s’étendre le long de l’orbite postérieure au niveau du canthus médial ou tout simplement supérieur à cela (Figure 4B). Dans certaines dissections, les incisions pour enlever l’OSLG et l’ILG seront connectées.REMARQUE : Lors de l’exécution de la chirurgie bilatérale, marquez les deux orbites en ce moment. Couper un morceau de fourrure de 2 à 3 cm de large avec des cisailles sur la surface latérale de chaque cuisse pour permettre le placement d’une plaque de cautérisation monopolaire. Appliquer le gel à ultrasons pour assurer un bon contact électrique avec la plaque de cautérisation monopolaire. Placez un cathéter intraveineux de 25 G (IV) dans l’une des veines marginales de l’oreille pour administrer des médicaments ou des liquides si nécessaire. Donner de la xylazine sous-cutanée (1 mg/kg) et de la kétamine IV (15 mg/kg) pour l’induction initiale de l’anesthésie (par l’accès IV).REMARQUE : Si le lapin est sous sédatif à l’avance avec de l’acépromazine suffisante pour conserver le point de terminaison décrit à l’étape 2.3, utilisez la sédation du masque à gaz avec l’isoflurane comme alternative. Placez une voie aérienne de masque laryngé e tenu en place à l’aide d’une bande élastique ou d’une ficelle pour fixer et entretenir les voies respiratoires. Connectez le masque à la machine d’anesthésie avec un flux d’oxygène réglé à 1 L/min. Fixer l’isoflurane à 5% d’abord, puis réduire comme toléré en fonction du niveau de sédation animale. Maintenir l’isoflurane à ou au-dessus de 2% jusqu’à la fermeture finale de la plaie.REMARQUE : Évaluer le niveau de sédation en surveillant la fréquence respiratoire et les mouvements en réponse à des stimuli chirurgicaux ou douloureux. Augmentez la profondeur de l’anesthésie si le taux respiratoire augmente au-dessus de 10 respirations par minute, si le lapin commence à mâcher sur le mainteneur des voies respiratoires, ou si des mouvements en réponse à des stimuli douloureux sont observés. Surveillez l’oxymétrie des impulsions, la capnographie, la pression artérielle, la température corporelle rectale et la fréquence cardiaque à l’aide d’un dispositif de surveillance multiparamètres ou d’autres dispositifs appropriés. Surveillez les éléments vitaux en permanence pendant la procédure et enregistrez toutes les 10 à 15 min. Placez le lapin sur la table de la salle d’opération (OR) au-dessus d’un coussin chauffant pour prévenir l’hypothermie. Inclinez la table en position inverse de Trendelenburg à environ 30 degrés pour minimiser les saignements. Préparer la zone chirurgicale avec une solution povidone-iode diluée à demi-force avec de l’eau stérile et draper afin de maintenir un champ stérile. 5. Dacryoadenectomy chirurgical complet REMARQUE : La dacryoadenectomy chirurgicale complète, comme décrit ci-tête, a été faite utilisant 0.3 forceps de tissu, ciseaux de tenotomy, forceps de tissu non-dentés, et ciseaux. Ces instruments peuvent être échangés avec des instruments similaires qui remplissent la même fonction en fonction de la préférence du chirurgien. Retirez d’abord l’OSLG. Infiltrer les sites d’incision (lignes de stylo de marquage chirurgical et couvercle postérieur supérieur) avec un mélange de 50:50 de lidocaïne de 2% avec 1:100.000 épinéphrine et 0.5% bupivacaine utilisant une seringue de 5 cc avec une aiguille de 30 G (figure 5A).REMARQUE : La taille de la seringue et de l’aiguille n’est pas critique. Utilisez une aiguille du Colorado reliée à une unité électrochirurgicale pour faire les incisions de la peau le long des marques chirurgicales. Les paramètres peuvent varier en fonction de la réponse clinique et se sirent généralement entre 10 et 15 unités pour la coupe et la coagulation (figure 5B). Appliquer la tension opposée à travers l’incision de la peau pour séparer les tissus et exposer les fibres musculaires frontoscutularis sous-jacentes. Appliquer une pression médiale sur le globe pour faciliter la visualisation de l’OSLG, considéré comme un tissu bombé situé juste médial ou profond aux fibres musculaires frontoscutularis. Si nécessaire, déplacez ces fibres musculaires sur le côté afin d’exposer l’incisure sous-jacente. Avec des forceps à dents (0,3) et des ciseaux capsulotomy, rétractez doucement et coupez la capsule fibreuse qui recense l’OSLG. L’OSLG a généralement une couleur beige pâle (Figure 5C). À l’aide de forceps à dentousiqueous ou non à dent, saisissez le tissu de la glande OSLG et tirez-le doucement par l’incisure supérieure à l’aide d’une technique de « main sur main ». Couper de petites bandes fibreuses à l’aide de ciseaux capsulotomy pour libérer la glande de sa position dans l’orbite (Figure 5D).REMARQUE : Au fur et à mesure que le tissu de la glande OSLG est enlevé, il commencera à se resserrez en une grande structure tubulaire (canal excréteur principal). Lorsque la glande a été enlevée aussi complètement que possible, utilisez la cautérisation généreuse avec l’aiguille du Colorado pour créer l’omble de tissu, tronquant la glande dans l’incisure aussi profondément que possible. Cela servira plus tard de point de repère de confirmation lors de la suppression de la PSLG. Retirez le PSLG. Evert la paupière supérieure à l’aide d’un applicateur à pointe de coton. L’extrémité bulbeuse du PSLG est généralement facilement visible.REMARQUE : Dans certaines dissections anatomiques, il peut être possible de visualiser le conduit excréteur principal comme une structure linéaire pâle d’environ 1 ou 2 mm de large. Engagez le PSLG avec des forceps dentés (0,3) et retirez-le de la surface de la paupière tout en utilisant des ciseaux de capsulotomie pour couper autour de sa base en la séparant du tarse sous-jacent (figure 6A). Contrôlez le saignement modéré avec la cautérisation monopolaire. Appliquer une traction continue sur le tissu séparé pour maintenir un plan tissulaire pour la dissection. Cela permettra également d’enlever le conduit excréteur principal du SLG (figure 6B).REMARQUE : Au fur et à mesure que la dissection est effectuée, elle avance généralement vers la jante orbitale supérieure où il est possible de voir les marques de cautérisation laissées derrière de l’enlèvement de l’OSLG plus supérieur et medially situé. Resect l’ILG. Laisser entrer en vigueur au moins 5 min pour que l’anesthésique local prenne effet. Inciser la peau, le muscle dépresseur du palpebra inférieur, la partie zygomaticolabial du muscle zygomatique, et le muscle orbicularis avec l’aiguille de microdissection du Colorado et séparé comme pour l’OSLG dans la section 5.1. Maintenir l’hémostase avec la cautérisation monopolaire. Comme l’incision est portée plus profondément à travers le marquage de la peau, chercher l’éclat d’un plan fascial sur l’os zygomatique ou partie superficielle du muscle masseur. À ce stade, maintenez le plan tissulaire et portez-le de façon supérieure vers la jante orbitale à l’aide de l’aiguille du Colorado pour la coupe (Figure 7A).REMARQUE : Dans le but d’identifier l’ILG, il est plus facile d’exécuter cette partie de la dissection au-dessus de la tête de l’ILG qui est typiquement inférieure au limbus antérieur de l’oeil. Après avoir identifié et incisé la capsule entourant l’ILG, identifiez le tissu tan de l’ILG. Seule la partie antérieure de la tête de l’ILG sera visible (figure 7B). Cependant, la tête peut être suivie médialement comme il passe sous l’arc zygomatique et les transitions dans la queue (Figure 7C). Utilisez des ciseaux ténotomy pour couper le septum orbital le long de la jante inférieure exposant la partie plus postérieure de la queue ILG. Une fois que le plan tissulaire est identifié, étendre la dissection postérieurement le long de toute la ligne d’incision (figure 7D).REMARQUE : Le conduit de l’ILG passe par les tissus conjonctifs fibreux inférieurs pour entrer dans l’espace conjonctival inférieur dans l’aspect temporel du couvercle. À la jante postérieure, la queue de l’ILG peut avoir des configurations anatomiques variables. Parfois, il se termine inférieur au canthus postérieur (latéral), tandis que dans d’autres dissections, il s’étend plus supérieurement autour de l’orbite temporelle. Utilisez des soins extrêmes pour prévenir les dommages par inadvertance à l’approvisionnement en sang, que l’ILG reçoit des branches de l’artère carotide. L’approvisionnement en sang peut être vu pendant cette partie de la dissection (Figure 7E). Dans les cas où la queue se termine sous le canthus postérieur (latéral), il peut être nécessaire de couper en deux la partie temporelle du muscle frontoscutulaire pour exposer la queue de l’ILG, qui se trouve le long de l’os zygomatique. Après que l’ENSEMBLE de l’ILG a été isolé et exposé, retirez-le. En raison de sa grande taille, il est souvent préférable de couper la glande en deux avec des ciseaux et enlever la tête séparément de la queue. Procédez très prudemment lors de l’enlèvement de la tête de l’ILG car elle se trouve immédiatement à côté d’un grand sinus veineux dans l’orbite. Bien que le saignement de cette structure pendant les résections chirurgicales ne s’est pas produit, ont des aides hémostatiques suffisantes présentes pour atténuer ce risque. Après l’enlèvement de tous les tissus de glande, fermez le plan de tissu conjonctif profond avec les sutures interrompues multiples de teréphtalate d’éthylène 5-0. Fermez les muscles superficiels et la peau avec une polyglacttine en cours d’exécution 6-0 suture 910 (Figure 7F) en utilisant 0,3 forceps de tissu et un conducteur d’aiguille. 6. Soins post-procédurales Dérapalez les animaux et nettoyez les sites chirurgicaux avec de l’eau stérile. Appliquer l’antibiotique ophtalmique topique et onguent stéroïde (néomycine, polymyxine, bacitracin, et hydrocortisone) aux incisions. Continuez cette application deux fois par jour pendant 2 jours. Donnez une injection sous-cutanée de 20 ml de saline normale sur les omoplates à l’aide d’une aiguille de 26 G. Donnez de la buprénorphine sous-cutanée 0,01 mg/kg ou du kétoprofène 3 mg/kg pour le contrôle de la douleur à l’aide d’une seringue de 1 cc et d’une aiguille de 30 G.REMARQUE : Les animaux devraient retourner à leur apport alimentaire normal et à leurs activités dans un délai d’un à deux jours. Les lapins doivent être évalués au moins chaque semaine pour les signes cliniques de l’infection comme en témoigne l’enflure progressive, la douleur, l’érythème, le calor ou la décharge purulente sur les sites d’incision. Les animaux doivent également être observés pour s’assurer qu’ils ne commencent pas à rayer les sites d’incision / lignes de suture. Couper toutes les griffes avant la dacryoadenectomy peut être utile à cet égard. Si l’on observe des rayures des lignes d’incision, des colliers de protection standard peuvent être utilisés pour prévenir l’automutilation. Inversez l’anesthésie. Retirez le mainteneur des voies respiratoires après que l’animal a répondu aux stimuli et commence à montrer la mastication spontanée, mais avant que le mainteneur des voies respiratoires peut être endommagé. Surveillez les animaux pendant environ 1 h et 2 h ou jusqu’à ce qu’ils se soient complètement remis de l’anesthésie, comme en témoigne le mouvement spontané dans leurs cages. Évaluez les animaux pour la douleur et traitez de façon appropriée. Permettre aux animaux de récupérer pendant au moins 1 semaine après la chirurgie avant de prendre des mesures cliniques de DED.