Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

Durante el desarrollo del sistema nervioso, axons de neuronas presinápticas navegan a través de diversas regiones del cerebro para llegar a sus áreas objetivo. Cuando los axons invaden sus tejidos diana, establecen conexiones sinápticas con las neuronas diana postsinápticas. En muchos tipos de neuronas, los axons aumentan el número y la extensión espacial de las conexiones sinápticas que pueden hacer mediante la elaboración de redes de ramas terminales o arbores¹. La proyección retino-tectal de renacuajos de la rana acuática Xenopus laevis es un potente modelo de vertebrado para examinar los mecanismos subyacentes a la arborización terminal de axón y conectividad sináptica^2,3,4 . Los árboles axonales ópticos individuales de expresión de GFP con señalización molecular normal y alterada se pueden observar directamente en renacuajos de Xenopus vivos^5,6,7,8. Para expresar GFP solo o junto con versiones completas o truncadas de genes en un pequeño número de neuronas ópticas, utilizamos una técnica que implica microinyección/lipofección de ADN en los oculares de un día de edad Xenopus embriones^{9, 10}. Esta técnica fue desarrollada originalmente para estudiar los mecanismos de búsqueda de trayectoria de axón óptico en los renacuajos del Xenopus jóvenes, y desde entonces ha sido aplicada por nosotros y otros para determinar los mecanismos moleculares autónomos de la célula subyacentes a la axón óptico arborización en renacuajos Xenopus ^5,6,7,8,9,10.

Se han desarrollado técnicas alternativas para expresar genes exógenos en un pequeño número de neuronas ópticas en otras especies modelo, así como en X. laevis. Sin embargo, cada uno de estos enfoques presenta desafíos y limitaciones en comparación con la microinyección de REactivo de ADN/lipofección en los auriculares de embriones de Xenopus. En ratones, la transgénesis se puede utilizar para expresar genes en un pequeño número de neuronas ópticas, pero la generación de ratones transgénicos es costosa y consume mucho tiempo y ratones transgénicos a menudo presentan efectos secundarios indeseables^11. El pez cebra transgénico que expresa genes exógenos en las neuronas ópticas también se puede crear inyectando plásmidos en embriones de etapa de escisión temprana^12. Sin embargo, este proceso requiere la clonación de un promotor específico para expresar genes en un patrón de mosaico en neuronas ópticas en larvas de pez cebra¹². La frecuencia de expresión del ADN exógeno en las neuronas ópticas en el pez cebra transgénico también es algo menor (<30%) en comparación con los renacuajos Xenopus que fueron microinyectados con ADN/reactivo liposomal (30-60%)¹². En ovo electroporation también se ha utilizado para expresar genes en pequeños números de neuronas ópticas en polluelos^13. Sin embargo, este procedimiento no ha caracterizado completamente los mecanismos que establecen proyecciones ópticas porque la arborización del axón óptico no se puede imaginar en embriones de polluelos vivos intactos. Por último, varios laboratorios han utilizado la electroporación para transfectar genes en un pequeño número de neuronas ópticas en Xenopus tadpoles^14,15. Sin embargo, la electroporación requiere la optimización de equipos y protocolos (estimulador, electrodos, patrones espaciales y temporales de pulsos de onda) más allá de la utilizada para la microinyección de ADN/lipofección reactivo en los oculares de embriones Xenopus.

Nosotros y otros utilizamos anteriormente la técnica de microinyección/lipofección de ADN en los oculares de embriones Xenopus para determinar los mecanismos de señalización autónoma celular que establecen la arborización del axón óptico^{5,6, 7 , 8}. Inicialmente utilizamos este enfoque para diseccionar las funciones de la proteína adaptadora de Cadherin y Wnt en la arborización óptica axonal en Xenopus tadpoles^5,6. En un estudio, mostramos que se requiere la unión de la catenina a la catenina y a la PDZ, respectivamente, para iniciar y dar forma a los árboles axonales ópticos in vivo⁵. En un segundo informe, demostramos que los dominios de unión de catenina para la catenina y gSK-3o modulan de forma opuesta los patrones de proyección de los árboles axonales ventrales ópticos⁶. Más recientemente, identificamos roles para el factor Wnt, adenomatous poliposis coli (APC), en la regulación de las características morfológicas de los árboles axonales ópticos en Xenopus tadpoles⁷. Al co-expresar los dominios N-terminal y central de APC que modulan la estabilidad de la catenina y la organización del microtúbulos junto con la GFP en neuronas ópticas individuales, determinamos roles compartidos y distintos para estos dominios de interacción de APC en el número de rama, longitud, y el ángulo en los árboles axonales ópticos in vivo⁷. Otro laboratorio utilizó la técnica de microinyección/lipofección para determinar los roles autónomos celulares para la señalización por el receptor BDNF, TrkB, en los árboles axonales ópticos en xenopus renacuajos⁸. Este grupo mostró que la expresión de una ramificación dominante-negativa TrkB perturbado y maduración sináptica en los árboles de axón óptico individuales in vivo⁸. En general, la técnica de lipofección en Xenopus ya ha iluminado los roles específicos de diferentes genes en la ramificación de axón óptico en el entorno nativo.