Микроинъекция ДНК в глазные будни в Xenopus laevis Эмбрионы и изображения GFP Экспрессинг Оптические аксональные беседки в Intact, живые Ксенопус Tadpoles
Summary
Этот протокол призван продемонстрировать, как микровимизм ДНК / DOTAP смесь в глазные будни одного дня старый Xenopus laevis эмбрионов, и как изображение и реконструировать отдельные зеленые флуоресцентные белки (GFP), выражая оптические аксональные арборы в тектальных средних мозгов нетронутыми, живые головастики Xenopus.
Abstract
Первичная визуальная проекция головастиков водной лягушки Xenopus laevis служит отличной модельной системой для изучения механизмов, регулирующих развитие нейронной связи. Во время создания ретино-текальной проекции, оптические аксоны простираются от глаза и перемещаться по различным областям мозга, чтобы достичь своей целевой ткани, оптического тектума. Как только оптические аксоны попадают в тектум, они разрабатывают терминальные беседки, которые функционируют, чтобы увеличить количество синапических соединений, которые они могут сделать с целевыми интернейронами в тектуме. Здесь мы описываем метод выражения ДНК, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP), и усиление и потеря функции гена конструкций, в оптических нейронов (клетки ганглия) в эмбрионах Ксенопуса. Мы объясняем, как микровимировать комбинированный реагент ДНК/липотекции в глазные рецепторы однодневных эмбрионов, так что экзогенные гены выражаются в одном или небольшом количестве оптических нейронов. Пометки генов с GFP или совместного введения с плазмид GFP, терминал аксональных беседок отдельных оптических нейронов с измененной молекулярной сигнализации могут быть изображены непосредственно в мозге нетронутыми, живые головастики Xenopus несколько дней спустя, и их морфологии может быть количественно. Этот протокол позволяет определить клеточные молекулярные механизмы, лежащие в основе развития оптического аксона arborization in vivo.
Introduction
Во время развития нервной системы аксоны пресинаптических нейронов проходят через различные области мозга, чтобы достичь своих целевых областей. Когда аксоны вторгаются в их ткани-мишени, они устанавливают синаптические связи с постсинаптические нейроны-мишени. Во многих типах нейронов аксоны увеличивают количество и пространственную степень синапических связей, которые они могут сделать, разрабатывая сети терминальных ветвей или беседок1. Ретино-тектальная проекция головастиков водной лягушки Xenopus laevis является мощной позвоночной моделью для изучения механизмов, лежащих в основе аксонизации терминала и синаптической связи2,3,4 . Индивидуальный GFP, выражающий оптические аксональные беседки с нормальной и измененной молекулярной сигнализацией, можно наблюдать непосредственно в нетронутых, живых головастях Ксенопуса 5,6,7,8. Чтобы выразить GFP в одиночку или вместе с полнометражными или усеченными версиями генов в небольшом количестве оптических нейронов, мы используем технику, включающую микроинъекцию/липофекацию ДНК в глазные будки однодневных эмбрионов Ксенопуса 9, 10. Этот метод был первоначально разработан для изучения механизмов оптического аксона поиска путей в молодых головастиков Xenopus, и с тех пор применяется нами и другими для определения клеточных автономных молекулярных механизмов, лежащих в основе оптического аксона беседка в Ксенопус головастики5,6,7,8,9,10.
Альтернативные методы экспрессирования экзогенных генов в небольшом количестве оптических нейронов были разработаны в других видах моделей, а также в X. laevis. Тем не менее, каждый из этих подходов представляет проблемы и ограничения по сравнению с микроинъекцией ДНК / липотекции реагента в глазных рецепторах эмбрионов Ксенопуса. У мышей трансгенез может быть использован для выражения генов в небольшом количестве оптических нейронов, но генерация трансгенных мышей является дорогостоящим и трудоемким и трансгенных мышей часто присутствует с нежелательными побочными эффектами11. Трансгенные зебры, которые выражают экзогенные гены в оптических нейронов также могут быть созданы путем введения плазмиды в ранней стадии декольте эмбрионов12. Тем не менее, этот процесс требует клонирования конкретного промоутера, чтобы выразить гены в мозаичном рисунке в оптических нейронов в личинки зебры12. Частота экспрессии экзогенной ДНК в оптических нейронах у трансгенных зебры также несколько ниже (Злт;30%) по сравнению с Ксенопус головастики, которые были микровведены с ДНК / липосомальный реагент (30-60%)12. В ово электропорации также используется для выражения генов в небольших количествах оптических нейронов у птенцов13. Тем не менее, эта процедура не смогла полностью охарактеризовать механизмы, которые устанавливают оптические проекции, потому что оптический аксон беседки не могут быть изображены в нетронутых, живых эмбрионов цыпленка. Наконец, несколько лабораторий использовали электропорации для трансфекта генов в небольшое количество оптических нейронов в Ксенопус головастики14,15. Тем не менее, электропорация требует оптимизации оборудования и протоколов (стимулятор, электроды, пространственные и временные модели волновых импульсов) за то, что используется для микроинъекции ДНК / липотекции реагента в глазные рецепторы эмбрионов Ксенопуса.
Мы и другие ранее использовали метод микроинъекции / липотекации ДНК в глазные рецепторы эмбрионов Ксенопуса для определения клеточных автономных механизмов сигнализации, которые устанавливают оптический аксон беседы5,6, 7 (г. , 8. Мы первоначально использовали этот подход, чтобы вскрыть функции Cadherin и Wnt адаптер белка -катенин в оптической аксональной арборизации в Ксенопус головастики5,6. В одном исследовании мы показали, что связывание к катенину и PD, соответственно, требуется для иначины и формирования оптических аксональных беседок in vivo5. Во втором отчете мы продемонстрировали, что связывающие домены для кятенина и ГСК-3 противоположники модулируют проекционные модели брюшной оптической аксональной арборы6. Совсем недавно мы определили роли для фактора Wnt, аденоматозной полипозной палочки (APC), в регулировании морфологических особенностей оптических аксональных беседок в Головаки Xenopus 7. Совместно выражая N-терминал и центральные домены APC, которые модулируют стабильность и микротубулы вместе с GFP в отдельных оптических нейронах, мы определили общие и различные роли для этих доменов взаимодействия APC на номере филиала, длина и угол в оптических аксональных беседок in vivo7. Другая лаборатория использовала метод микроинъекции/липофектирования для определения клеточных автономных ролей для сигнализации рецептором BDNF, TrkB, в оптических аксональных беседках в головастях Ксенопуса 8. Эта группа показала, что выражение доминирующей отрицательной TrkB возмущенвной ветвления и синаптической созревания в отдельных оптических аксонов беседки in vivo8. В целом, метод липотекации в Ксенопууже уже освещает специфические роли различных генов в ветвящейся оптический аксон в родной среде.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы демонстрируем, как выразить экзогенные конструкции ДНК в одном или малом количестве оптических нейронов и как изображение отдельных GFP, выражающих оптические аксональные беседки с нормальными и измененными молекулярными сигнализациями в нетронутых, живых головастях …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Университет Туро Калифорнийский колледж остеопатической медицины за поддержку наших исследований. Мы признаем предыдущих студентов в лаборатории (Эстер Ву, Грегори Пэн, Тэгун Джин, Джон Лим), которые помогли реализовать эту технику микроинъекций в нашей лаборатории. Мы благодарны доктору Кристинхол, в чьей лаборатории была впервые разработана эта методика микроинъекций/липотекции ДНК в эмбрионах Ксенопуса.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
