Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular

Muchas neuropatologías están relacionadas con el estado neuroinflamatorio que es un mecanismo complejo que se considera cada vez más, pero todavía mal entendido porque los procesos inmunológicos son diversos y dependen del entorno celular. De hecho, los trastornos del SNC no implican sistemáticamente las mismas señales de activación y las poblaciones de células inmunitarias y, por lo tanto, las respuestas pro o antiinflamatorias son difíciles de evaluar como causas o consecuencias de las patologías. Los macrófagos residentes en el cerebro llamados “microglia” parecen estar en la interfaz entre los sistemas nervioso e inmune¹. Las microglia tienen un origen mieloide y se derivan del saco de yema durante la hematopoyesis primitiva para colonizar el cerebro, mientras que los macrófagos periféricos se derivan del hígado fetal durante la hematopoyesis definitiva para convertirse en macrófagos periféricos^2. Las células de microglia se comunican con las neuronas y las células gliales derivadas de las neuronas, como los astrocitos y los oligodendrocitos^3. Varios estudios recientes han demostrado que la microglia está implicada en la plasticidad neuronal durante el desarrollo del SNC y la homeostasis de tejido adulto, y también en el estado inflamatorio asociado con enfermedades neurodegenerativas^4,,5. De lo contrario, la integridad de la barrera hematoencefálica puede verse comprometida en otras patologías del SNC. Las respuestas inmunitarias, especialmente en el cáncer de glioblastoma multiforme, no son apoyadas sólo por células de microglia, ya que la barrera hematoencefálica se reorganiza a través de procesos angiogénicos y la presencia de vasos linfáticos^6,,7. Por lo tanto, una infiltración grande de macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) ocurre en el tumor cerebral a través de los mecanismos de angiogénesis dependientes del tumor⁸. Las células cancerosas ejercen una influencia significativa en los DMO infiltrados que conducen a propiedades inmunosupresoras y crecimiento tumoral⁹. Por lo tanto, la comunicación entre las células inmunitarias y su microambiente cerebral es difícil de entender ya que el origen celular y las señales de activación son diversas^10,,11. Por lo tanto, es interesante aprehender las funciones de las firmas moleculares asociadas a células inmunes en condiciones fisiológicas. En este sentido, la comunicación célula-célula entre las células inmunitarias y el microambiente celular se puede estudiar mediante la liberación de vesículas extracelulares (EV).

Los vehículos eléctricos se están estudiando cada vez más en la regulación de las funciones inmunitarias en condiciones sanas y patológicas^12,,13. Se pueden tener en cuenta dos poblaciones, exosomas y microvesículas. Presentan diferentes rangos de biogénesis y tamaño. Los exosomas son vesículas de 30-150 nm de diámetro y se generan a partir del sistema endosomal y se secretan durante la fusión de cuerpos multivesiculares (MVB) con la membrana plasmática. Las microvesículas miden unos 100–1.000 nm de diámetro y son generadas por un árbol externo de la membrana plasmática celular¹⁴. Debido a que la discriminación de exosoma versus microvesículas todavía es difícil de realizar de acuerdo con el tamaño y los patrones moleculares, sólo utilizaremos el término EV en el presente informe. La comunicación asociada a los vehículos ves por el VEHÍCULO en el SNC representa un mecanismo ancestral ya que los estudios mostraron su participación en especies de invertebrados, incluidos nematodos, insectos o anélidos^15,,16. Además, los resultados que muestran que los vehículos eléctricos pueden comunicarse con células de diferentes especies demuestran que este mecanismo es un sistema de bloqueo de teclas, basado primero en el reconocimiento de moléculas de superficie entre vesículas y células receptoras y luego permitiendo la absorción de mediadores^16,,17. De hecho, los vehículos eléctricos contienen muchas moléculas como proteínas (por ejemplo, enzimas, transducción de señales, factor de biogénesis), lípidos (por ejemplo, ceramida, colesterol) o ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARNm o miRNAs) que actúan como reguladores directos o indirectos de las actividades celulares receptoras¹⁴. Es por eso que también se realizaron estudios metodológicos en células inmunitarias para aislar los vehículos eléctricos y caracterizar completamente sus firmas proteicas^18,,19.

Los primeros estudios demostraron la liberación de exosomas de la microglia de rata cultivada primaria como un mecanismo inducible después de una activación dependiente de Wnt3a o serotonina^20,21. Funcionalmente en el SNC, los vehículos eléctricos derivados de la microglia regulan la liberación de vesículas sinápticas por terminales presinápticos en las neuronas que contribuyen al control de la excitabilidad neuronal^22,,23. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia también podrían propagar la respuesta inflamatoria mediada por citoquinas en regiones cerebrales grandes^24,,25. Es importante destacar que los diversos ligandos para la familia de receptores similares a peajes podrían activar producciones específicas de vehículos eléctricos en la microglia²⁶. Por ejemplo, los estudios in vitro muestran que las líneas celulares BV2 de microglia activada por LPS producen contenidos diferenciales de EV, incluidas las citoquinas proinflamatorias^27. Por lo tanto, la diversidad funcional de las subpoblaciones de células inmunitarias en el SNC, la microglia y la infiltración de DMO, podría evaluarse a través de sus propias poblaciones de EV, incluido el impacto EV en las células receptoras y la identificación del contenido de EV.

Anteriormente describimos métodos para evaluar las propiedades funcionales de los vehículos eléctricos derivados de microglia y BMDM después de su aislamiento^16,19. En el presente informe, proponemos evaluar de forma independiente el efecto de los vehículos eléctricos derivados de la microglia en el crecimiento de la neurita, y el efecto de los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en el control de los agregados celulares del glioma. Este estudio también propone un amplio análisis proteómico de las fracciones EV con el fin de validar el procedimiento de aislamiento EV, así como identificar las firmas de proteínas biológicamente activas. Los efectos beneficiosos y el descifrado molecular de los contenidos de EV podrían ayudar a su posible manipulación y uso como agentes terapéuticos en trastornos cerebrales.