Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

Muitas neuropatologias estão relacionadas ao estado neuro-inflamatório, que é um mecanismo complexo que é cada vez mais considerado, mas ainda mal compreendido porque os processos imunológicos são diversos e dependem do ambiente celular. De fato, os transtornos do SNC não envolvem sistematicamente os mesmos sinais de ativação e populações de células imunes e, portanto, as respostas pró ou anti-inflamatórias são difíceis de avaliar como causas ou consequências das patologias. Os macrófagos residentes no cérebro chamados “microglia” parecem estar na interface entre o sistema nervoso e imunológico¹. A microglia tem origem mielóide e é derivada do saco de gema durante hematopeiese primitiva para colonizar o cérebro, enquanto macrófagos periféricos são derivados do fígado fetal durante hematopoiese definitiva para se tornarem macrófagos periféricos². As células microglia se comunicam com neurônios e células gliais derivadas de neurônios, como astrócitos e oligodendrócitos³. Vários estudos recentes demonstraram que a microglia está envolvida na plasticidade neuronal durante o desenvolvimento do CNS e na homeostase do tecido adulto, e também no estado inflamatório associado às doenças neurodegenerativas^4,,5. Caso contrário, a integridade da barreira cerebral sanguínea pode ser comprometida em outras patologias do CNS. As respostas imunes, especialmente no câncer multiforme glioblastoma, não são suportadas apenas por células microglia, pois a barreira cerebral sanguínea é reorganizada através de processos angiogênicos e a presença de vasos linfáticos^6,,7. Portanto, uma grande infiltração de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) ocorre no tumor cerebral ao longo de mecanismos de angiogênese dependentes do tumor⁸. As células cancerígenas exercem uma influência significativa sobre os BMDMs infiltrados que levam a propriedades imunossupressores e crescimento do tumor⁹. Assim, a comunicação entre as células imunes e seu microambiente cerebral é difícil de entender, pois a origem celular e os sinais de ativação são diversos^10,11. É, portanto, interessante apreender as funções de assinaturas moleculares associadas às células imunes em condições fisiológicas. Nesse sentido, a comunicação celular-celular entre células imunes e microambiente celular pode ser estudada através da liberação de vesículas extracelulares (EVs).

Os EVs estão sendo estudados cada vez mais na regulação das funções imunológicas em condições saudáveis e patológicas^12,13. Duas populações, exosóis e microvesículos, podem ser levadas em conta. Eles apresentam diferentes biogêneses e faixas de tamanho. Os exossomos são vesículas de ~30-150 nm de diâmetro e são gerados a partir do sistema endosomal e secretados durante a fusão de corpos multivesiculares (MVBs) com a membrana plasmática. Os microvesículos têm cerca de 100-1.000 nm de diâmetro e são gerados por um brotamento externo da membrana plasmática^{celular 14}. Como a discriminação exósia versus microvesícula ainda é difícil de perceber de acordo com o tamanho e os padrões moleculares, usaremos apenas o termo EVs no presente relatório. A comunicação associada ao EV no CNS representa um mecanismo ancestral, uma vez que estudos mostraram seu envolvimento em espécies invertebradas, incluindo nematoides, insetos ou annelids^15,16. Além disso, os resultados que mostram que os EVs podem se comunicar com células de diferentes espécies demonstram que esse mecanismo é um sistema de bloqueio de chaves, baseado primeiro no reconhecimento de moléculas superficiais entre vesículas e células receptoras e, em seguida, permitindo a absorção de mediadores^16,,17. De fato, os EVs contêm muitas moléculas como proteínas (por exemplo, enzimas, transdução de sinais, fator biogênese), lipídios (por exemplo, ceramida, colesterol) ou ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, mRNA ou miRNAs) agindo como reguladores diretos ou indiretos das atividades celulares receptoras¹⁴. É por isso que estudos metodológicos também foram realizados em células imunes para isolar EVs e caracterizar plenamente suas assinaturas proteicas^18,19.

Os primeiros estudos demonstraram a liberação de exosóis da microglia primária cultivada como um mecanismo indutor após uma ativação Wnt3a ou dependente de serotonina^20,21. Funcionalmente no CNS, os EVs derivados de microglia regulam a liberação de vesícula sináptica por terminais pré-sinápticos em neurônios que contribuem para o controle da excitabilidade neuronal^22,23. EVs derivados de microglia também poderiam propagar a resposta inflamatória mediada por citocinas em grandes regiões cerebrais^24,25. É importante ressaltar que os diversos ligantes para a família receptora de pedágio podem ativar produções específicas de EVs na microglia²⁶. Por exemplo, estudos in vitro mostram que as linhas celulares Microglia BV2 ativadas pelo LPS produzem conteúdoes diferenciados de EV, incluindo citocinas pró-inflamatórias²⁷. Portanto, a diversidade funcional de subpopulações de células imunes no CNS, microglia e BMDMs infiltrados, pode ser avaliada através de suas próprias populações de EV, incluindo o impacto do EV nas células receptoras e a identificação de conteúdos de EV.

Descrevemos anteriormente métodos para avaliar as propriedades funcionais dos EVs derivados de microglia e BMDM após seu isolamento^16,19. No presente relatório, propomos avaliar independentemente o efeito dos EVs derivados de microglia no crescimento do neurite e o efeito dos EVs derivados do macrófago no controle de agregados celulares glioma. Este estudo também propõe uma ampla análise proteômica das frações de EV, a fim de validar o procedimento de isolamento do EV, bem como identificar as assinaturas proteicas biologicamente ativas. Os efeitos benéficos e a decifração molecular do conteúdo de EV poderiam ajudar sua possível manipulação e uso como agentes terapêuticos em distúrbios cerebrais.