Caratterizzazione delle vescicoli extracellulari derivati dalle cellule immunitarie e studio dell'impatto funzionale sull'ambiente cellulare

Molte neuropatologie sono legate allo stato neuroinfiammatorio che è un meccanismo complesso che è sempre più considerato, ma ancora poco compreso perché i processi immunitari sono diversi e dipendono dall’ambiente cellulare. Infatti, i disturbi del SNC non comportano sistematicamente gli stessi segnali di attivazione e le stesse popolazioni di cellule immunitarie e quindi le risposte pro o antinfiammatorie sono difficili da valutare come cause o conseguenze delle patologie. I macrofagi residenti nel cervello chiamati “microglia” sembrano essere all’interfaccia tra il sistema nervoso e il sistema immunitario¹. La microglia ha un’origine mieloide e deriva dal sacco di tuorlo durante l’ematopoiesi primitiva per colonizzare il cervello, mentre i macrofagi periferici sono derivati dal fegato fetale durante l’ematopoiesi definitiva per diventare macrofagi periferici². Le cellule di microglia comunicano con neuroni e cellule gliali derivate da neuroni come astrociti e oligodendrociti³. Diversi studi recenti hanno dimostrato che le microglia sono coinvolte nella plasticità neuronale durante lo sviluppo del SNC e l’omeostasi del tessuto adulto, e anche nello stato infiammatorio associato alle malattie neurodegenerative^4,5. In caso contrario, l’integrità della barriera ematoence-encefalica può essere compromessa in altre patologie CNS. Le risposte immunitarie, soprattutto nel cancro del glioblastoma multiforme, non sono supportate solo dalle microglia come la barriera elica viene riorganizzata attraverso processi angiogenici e la presenza di vasi linfatici^6,7. Pertanto, un’infiltrazione di macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) si verifica nel tumore cerebrale durante i meccanismi di angiogenesi dipendenti dal tumore⁸. Le cellule tumorali esercitano un’influenza significativa sui BMM infiltrati che portano alle proprietà immunosoppressive e alla crescita del tumore⁹. Così la comunicazione tra le cellule immunitarie e il loro microambiente cerebrale è difficile da capire in quanto l’origine cellulare e i segnali di attivazione sono diversi^10,11. È quindi interessante comprendere le funzioni delle firme molecolari associate alle cellule immunitarie in condizioni fisiologiche. A questo proposito, la comunicazione cellule-cellule tra cellule immunitarie e microambiente cellulare può essere studiata attraverso il rilascio di vesciche extracellulari (EV).

I VE sono sempre più studiati nella regolazione delle funzioni immunitarie in condizioni sane e patologiche^12,13. Due popolazioni, esosomi e microvescicoli, possono essere prese in considerazione. Presentano diverse biogenesi e gamme di dimensioni. Gli esosomi sono vesciche di diametro compreso tra 30 e 150 nm e sono generati dal sistema endosomico e secreti durante la fusione di corpi multivessicolari (MVB) con la membrana plasmatica. I microvescicoli hanno un diametro di circa 100-1.000 nm e sono generati da un germogliamento esteriore dalla membrana plasmatica cellulare¹⁴. Poiché la discriminazione esosoma contro microvescicolo è ancora difficile da realizzare in base alle dimensioni e ai modelli molecolari, useremo solo il termine EV nella presente relazione. La comunicazione associata a EV nel SNC rappresenta un meccanismo ancestrale poiché gli studi hanno mostrato il loro coinvolgimento nelle specie invertebrate tra cui nematodi, insetti o annelidi^15,16. Inoltre, i risultati che mostrano che i veicoli elettrici possono comunicare con cellule di diverse specie dimostrano che questo meccanismo è un sistema di blocco a chiave, basato prima sul riconoscimento superficie-molecola tra vescicoli e cellule riceventi e quindi consentendo l’assorbimento di mediatori^16,17. Infatti, gli EVi contengono molte molecole come proteine (ad esempio, enzimi, trasduzione del segnale, fattore biogenesi), lipidi (ad esempio, ceramide, colesterolo) o acidi nucleici (ad esempio DNA, mRNA o miRNA) che agiscono come regolatori diretti o indiretti delle attività delle cellule riceventi¹⁴. Ecco perché sono stati effettuati studi metodologici anche sulle cellule immunitarie per isolare i veicoli elettrici e caratterizzare completamente le loro firme proteiche^18,19.

I primi studi hanno dimostrato il rilascio di esosomi dalla microglia primaria di ratti coltivati come meccanismo inducibile dopo un’attivazione Wnt3a- o serotonina-dipendente^20,21. Funzionalmente nel SNC, gli EV derivati dalla microglia regolano il rilascio di vesciboli era sinaptiche da terminali pressinaptici nei neuroni che contribuiscono al controllo dell’eccitabilità neuronale^22,23. Gli EV derivati dalla microglia potrebbero anche propagare la risposta infiammatoria mediata da citochine nelle grandi regioni cerebrali^24,25. È importante sottolineare che i diversi ligandi per la famiglia di recettori a pedaggio potrebbero attivare produzioni specifiche di veicoli elettrici nella microglia²⁶. Ad esempio, studi in vitro mostrano che le linee cellulari microglia BV2 attivate da LPS producono contenuti EV differenziali, tra cui citochine pro-infiammatorie²⁷. Pertanto, la diversità funzionale delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nel SNC, nella microglia e nell’infiltrazione di BMM, potrebbe essere valutata attraverso le proprie popolazioni di EV, tra cui l’impatto EV sulle cellule riceventi e l’identificazione del contenuto di EV.

In precedenza abbiamo descritto metodi per valutare le proprietà funzionali degli EV derivati da microglia e BMDM dopo il loro isolamento^16,19. Nella presente relazione, proponiamo di valutare in modo indipendente l’effetto dei veicoli elettrici derivati dalla microglia sull’escrescenza dei neuriti e l’effetto dei VE derivati dai macrofaci sul controllo degli aggregati cellulari del glioma. Questo studio propone anche un’ampia analisi proteomica delle frazioni EV al fine di convalidare la procedura di isolamento EV e identificare le firme proteiche biologicamente attive. Gli effetti benefici e la decifrazione molecolare del contenuto di EV potrebbero aiutare la loro possibile manipolazione e uso come agenti terapeutici nei disturbi cerebrali.