Karakterisering van immuuncel-afgeleide extracellulaire vesicles en het bestuderen van functionele impact op celmilieu

Veel neuropathologieën zijn gerelateerd aan de neuro-inflammatoire toestand die een complex mechanisme is dat steeds meer wordt overwogen, maar nog steeds slecht begrepen omdat de immuunprocessen divers zijn en afhankelijk zijn van de celomgeving. De CNS-aandoeningen hebben immers niet systematisch dezelfde activeringssignalen en immuuncelpopulaties en dus zijn de pro- of ontstekingsremmende reacties moeilijk te beoordelen als oorzaken of gevolgen van pathologieën. De hersenen resident macrofagen genaamd “microglia” lijken te zijn op de interface tussen het zenuwstelsel en het immuunsysteem¹. Microglia hebben een myeloïde oorsprong en zijn afgeleid van de dooier zak tijdens primitieve hematopoiesis om de hersenen te koloniseren, terwijl perifere macrofagen zijn afgeleid van de foetale lever tijdens definitieve hematopoiesis te worden perifere macrofagen². De microglia cellen communiceren met neuronen en neuron-afgeleide gliacellen zoals astrocyten en oligodendrocyten³. Verschillende recente studies hebben aangetoond dat microglia betrokken zijn bij neuronale plasticiteit tijdens cns-ontwikkeling en adult tissue homeostase, en ook in de ontstekingstoestand geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten^4,5. Anders kan de integriteit van de bloedhersenbarrière worden aangetast in andere CNS-pathologieën. De immuunresponsen, vooral bij de glioblastoom multiforme kanker, worden niet alleen ondersteund door microgliacellen omdat de bloedhersenbarrière wordt gereorganiseerd door angiogene processen en de aanwezigheid van lymfevaten^6,7. Daarom vindt een grote beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) infiltratie plaats in de hersentumor gedurende tumorafhankelijke angiogenese mechanismen⁸. De kankercellen oefenen een aanzienlijke invloed uit op geïnfiltreerde BMDMs wat leidt tot immunosuppressieve eigenschappen en tumorgroei⁹. Zo is de communicatie tussen de immuuncellen en hun hersenen micro-omgeving is moeilijk te begrijpen als de cel oorsprong en activering signalen zijn divers^10,11. Het is dus interessant om de functies van immuuncel-geassocieerde moleculaire handtekeningen in fysiologische omstandigheden te vatten. In dit verband kan de celcelcommunicatie tussen immuuncellen en celmicro-omgeving worden bestudeerd door het vrijkomen van extracellulaire adereilanden (EV’s).

De EV’s worden meer en meer bestudeerd in de regulatie van immuunfuncties in gezonde en pathologische aandoeningen^12,13. Er kan rekening worden gehouden met twee populaties, exosomen en microvesicles. Ze presenteren verschillende biogenese en grootte bereiken. De exosomen zijn vesicles van ~ 30-150 nm diameter en worden gegenereerd uit het endosomale systeem en uitgescheiden tijdens de fusie van multivesiculaire lichamen (MVBs) met het plasmamembraan. De microvesicles zijn ongeveer 100-1.000 nm in diameter en worden gegenereerd door een naar buiten ontluikende uit de cel plasma membraan¹⁴. Omdat de exosoom versus microvesicle discriminatie is nog steeds moeilijk te realiseren op basis van de grootte en moleculaire patronen, zullen we alleen gebruik maken van de term EV’s in het huidige rapport. De ev-geassocieerde communicatie in het CNS vertegenwoordigt een voorouderlijk mechanisme sinds studies hun betrokkenheid bij ongewervelde soorten, waaronder aaltjes, insecten of annelids¹⁵,^16. Bovendien tonen de resultaten waaruit blijkt dat EV’s kunnen communiceren met cellen van verschillende soorten, dat dit mechanisme een sleutelslotsysteem is, dat eerst gebaseerd is op oppervlaktemolecuulherkenning tussen vesicles en ontvangende cellen en vervolgens de opname van bemiddelaars^16,17. De EV’s bevatten namelijk veel moleculen zoals eiwitten (bijvoorbeeld enzymen, signaaltransductie, biogenesefactor), lipiden (bijvoorbeeld ceramide, cholesterol) of nucleïnezuren (bijvoorbeeld DNA, mRNA of miRNAs) die fungeren als directe of indirecte regelgevers van de ontvangende celactiviteiten¹⁴. Daarom werden ook methodologische studies uitgevoerd op immuuncellen om EV’s te isoleren en hun eiwithandtekeningen volledig te karakteriseren^18,19.

De vroegste studies toonden het vrijkomen van exosomen uit primaire gekweekte rat microglia als een induceerbaar mechanisme na een Wnt3a- of serotonine-afhankelijke activering^20,21. Functioneel in het CNS, microglia-afgeleide EV’s reguleren de synaptische blaasjes release door presynaptische terminals in neuronen bij te dragen aan de controle van de neuronale prikkelbaarheid^22,23. Microglia-afgeleide EV’s kunnen ook cytokines-gemedieerde ontstekingsrespons verspreiden in grote hersengebieden^24,25. Belangrijk is dat de diverse ligands voor tol-achtige receptor familie specifieke producties van EV’s in de microglia²⁶kan activeren. Bijvoorbeeld, in vitro studies tonen aan dat LPS-geactiveerde microglia BV2 cellijnen differentiële EV-inhoud produceren, waaronder pro-inflammatoire cytokines²⁷. Daarom kan de functionele diversiteit van immuuncelsubpopulaties in de CNS, microglia en het infiltreren van BMDMs, worden geëvalueerd door middel van hun eigen EV-populaties, waaronder de EV-impact op de ontvangende cellen en de identificatie van EV-inhoud.

We beschreven eerder methoden om de functionele eigenschappen van microglia- en BMDM-afgeleide EV’s te evalueren na hun isolatie^16,19. In dit rapport stellen we voor om onafhankelijk het effect van microglia-afgeleide EV’s op neuritische uitgroei en het effect van macrofaag-afgeleide EV’s op de controle van glioomcelaggregaten te evalueren. Deze studie stelt ook een brede proteomische analyse van de EV-breuken voor om de EV-isolatieprocedure te valideren en de biologisch actieve eiwithandtekeningen te identificeren. De gunstige effecten en het moleculair ontcijferen van EV-inhoud kunnen helpen hun mogelijke manipulatie en gebruik als therapeutische middelen in hersenaandoeningen.