Um método detalhado é fornecido aqui descrevendo a purificação, o redobramento, e a caracterização de nanopartículas de proteína Self-montagem (SAPNs) para o uso no desenvolvimento da vacina.
A auto-montagem de nanopartículas de proteína (SAPNs) função como exposições de antígeno repetitivo e pode ser usado para desenvolver uma ampla gama de vacinas para diferentes doenças infecciosas. Neste artigo nós demonstramos um método para produzir um núcleo de SAPN que contem um conjunto do feixe da seis-hélice (SHB) que seja capaz de apresentar antígenos em uma conformação trimérico. Nós descrevemos a expressão do SHB-SAPN em um sistema de E. coli , assim como as etapas necessárias da purificação da proteína. Nós incluímos uma etapa da lavagem do isopropanol para reduzir o lipopolysaccharide bacteriano residual. Como uma indicação da identidade e da pureza da proteína, a proteína reagiu com os anticorpos monoclonais conhecidos em análises ocidentais do borrão. Após o redobramento, o tamanho das partículas caiu na escala esperada (20 a 100 nanômetro), que foi confirmado pelo espalhamento de luz dinâmico, pela análise de seguimento da nanopartícula, e pela microscopia de elétron da transmissão. A metodologia descrita aqui é otimizada para o SHB-SAPN, porém, com apenas ligeiras modificações pode ser aplicada a outros constructos SAPN. Este método também é facilmente transferível para a produção em grande escala para a fabricação de GMP para vacinas humanas.
Enquanto o desenvolvimento tradicional da vacina se concentrou nos patógenos inativados ou atenuados, o foco das vacinas modernas mudou para as vacinas de subunidades1. Esta abordagem pode levar a uma resposta mais orientada, e potencialmente mais eficaz vacina candidatos. No entanto, um dos principais inconvenientes é que as vacinas subunitárias não são particulados como organismos inteiros que podem resultar em imunogenicidade reduzida2. Uma nanopartícula como um sistema de exibição de antígeno repetitivo pode ter os benefícios tanto da abordagem da vacina de subunidade direcionada quanto da natureza particulada de todo o organismo1,3.
Entre os tipos existentes de nanovaccines, os conjuntos de proteína projetados racionalmente permitem o projeto e o desenvolvimento de candidatos vacinais que podem apresentar cópias múltiplas do antígeno potencial em uma conformação nativo-como1,4 ,5,6. Um exemplo desses conjuntos proteicos são as nanopartículas proteicas Automontantes (SAPNs)7. Os SAPNs são baseados em domínios bobinados e são tradicionalmente expressos em Escherichia coli8. Os candidatos à vacina SAPN foram desenvolvidos para diversas doenças como malária, SARS, influenza, toxoplasmose e HIV-19,10,11,12,13 , 14 anos de , 15 anos de , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , o projeto 19. The de cada candidato de SAPN é específico ao micróbio patogénico do interesse, entretanto, a produção, a purificação, e as técnicas de redobramento são geralmente amplamente aplicáveis.
Um dos nossos interesses actuais é uma vacina eficaz para o VIH-1. Em RV144 — o único ensaio clínico de fase III de umavacina contra oVIH-1 que demonstrou eficácia modesta — o risco reduzido de infeção foi correlacionado com anticorpos IgG ao ciclo V1V2 da proteína envelope20,21. O nativo-como a apresentação trimérico desta região é pensado para ser importante para a imunogenicidade protetora22. Para apresentar o laço de V1V2 em tão perto ao nativo-como a conformação como possível, nós desenvolvemos uma prova do candidato da vacina do princípio SAPN que continha o pacote da seis-hélice da borne-fusão do envelope de HIV-1 (SHB) para apresentar o laço V1V2 na conformação correta9 . Este candidato foi reconhecido por anticorpos monoclonais conhecidos à proteína do envelope de HIV-1. Camundongos imunizados com V1V2-SHB-SAPN levantaram V1V2 anticorpos específicos, que, mais importante, vinculados a gp70 V1V2, os epítopos conformacionais corretos9. O núcleo de SHB-SAPN poderia ter outras funções além do papel como um portador para o laço de HIV-1 V1V2. Aqui nós descrevemos uma metodologia detalhada para a expressão, a purificação, o redobramento, e a validação do núcleo de SHB-SAPN. A seleção da seqüência, o projeto da nanopartícula, o clonagem molecular, e a transformação de e. coli foram descritos previamente9.
A nanotecnologia oferece muitas vantagens e soluções para o desenvolvimento de vacinas de subunidades. Nanovaccines pode repetidamente apresentar antígenos como particulados ao sistema imunológico hospedeiro aumentando a imunogenicidade26. Embora existam muitos tipos diferentes de nanovaccines, acreditamos que os compostos de proteína projetada de novo parecem ser a abordagem mais forte para o desenvolvimento da vacina1. Podem ser projetados sem nenhuma homologia da seqüência às proteínas do anfitrião e apresentar o antígeno do interesse perto do nativo-como a conformação ao fornecer o baixo custo de produção e rendimentos elevados do produto. Um excelente exemplo dessa abordagem é a tecnologia SAPN, que temos aplicado a vacinas contra múltiplas doenças infecciosas7. Abordando as dificuldades no desenvolvimento da vacina HIV-1, nós projetamos um núcleo SHB-SAPN original para apresentar eficazmente o antígeno de V1V2 em uma conformação de trimérico nativa-como9. Muitos alvos vacinais, particularmente para doenças virais, estão atuais como trímeros27. Este fenômeno indica que nosso projeto de SAPN tem implicações largas para o desenvolvimento de vacinas do subunidade.
Neste método, demonstramos como produzir SHB-SAPNs em um sistema de expressão de E. coli . Nós expressamos rendimentos elevados da proteína (aproximadamente 6 mg/100 mL da cultura). A proteína continha 10 histidinas e foi facilmente purificada usando uma cromatografia de afinidade metálica imobilizada com a coluna Ni2 + . Este comprimento do his-tag foi encontrado para ser o ideal para o rendimento o mais elevado da proteína. A proteína purificada continha o comprimento total da proteína projetada como indicado pela presença do N-terminal histag e da repetição de criselefantina terminal C. Foram utilizadas técnicas amplamente aceitas e otimizadas para a expressão, produção e caracterização do núcleo SHB-SAPN. A falta da produção da proteína full-length durante o desenvolvimento de um SAPN que contem um epítopo novo da proteína poderia indicar um problema da expressão do gene na pilha de anfitrião. Se isso acontecer, o gene e o sistema de expressão devem ser redesenhados e adaptados ao protocolo descrito. A modificação do tempo ou da intensidade da sonicação também pode aumentar a concentração da proteína de comprimento total prevista.
As partículas redobradas estavam na escala esperada do tamanho (20 a 100 nanômetro)8,24,25 como determinado por DLS e pela análise de seguimento da nanopartícula. Esses resultados foram confirmados com o uso de TEM. Se há uns problemas nesta etapa, é normalmente devido a um problema com o pH ou a força iónica do amortecedor de redobramento. Quando partículas de tamanho grande são detectadas nas técnicas de dimensionamento de partículas, ela indica agregação, que pode ser evitada aumentando o pH do buffer de redobramento. Se as partículas não forem detectadas pela DLS, verifique a concentração da proteína e verifique o pH do tampão. A concentração final de proteínas para DLS deve ser de pelo menos 100 μg/mL. Se a concentração não é o problema, indica a abundância de partículas pequenas, incompletamente formadas, cuja concentração pode ser reduzida diminuindo o pH. Alternativamente, a concentração do cloreto de sódio pode ser ajustada à escala a melhor para minimizar a presença de partículas com tamanho indesejado.
Finalmente, usando uma etapa da lavagem do isopropanol durante a purificação nós pudemos reduzir contaminando LPS do anfitrião e. coli a 0, 1 eu/ΜG de SAPN que está abaixo do limite da administração do alimento e da droga (FDA) de 5 UE/quilograma do peso corporal para produtos injetáveis o nível 28. this pode mais ser reduzido usando uma coluna da troca do aníon igualmente conhecida como a coluna de Q. Se os altos níveis de endotoxina ainda estão presentes, verifique todos os materiais que foram utilizados para a preparação do tampão. Recorde usar somente os produtos vidreiros depyrogenated e o plasticware livre da endotoxina neste método.
Estes resultados indicam que nós desenvolvemos com sucesso um método para produzir o núcleo de SHB-SAPN que pode ser usado para estudos pre-Clinical da imunização. Este método com apenas ligeiras modificações, se houver, pode ser aplicado à purificação de SHB-SAPNs quando um antígeno de interesse é adicionado. Usando esse método como um ponto de partida uma das principais alterações está na etapa de eluição. Proteínas diferentes eluir em concentrações diferentes do imidazol que devem ser determinadas experimentalmente. A outra diferença principal pode ser a composição do buffer de redobramento. A otimização exigiria testar diferentes condições de pH, bem como forças iônicas.
Em consideração do trabalho futuro, somente duas modificações ligeiras são necessárias para permitir a aplicação humana do SHB-SAPN. O primeiro é que o vetor da expressão precisa de ser mudado a um marcador selecionável da resistência do canamicina devido à alergia da ampicilina nos seres humanos29. A outra exigência principal da fabricação da proteína para o uso humano é produzir o SHB-SAPN em meios produto-livres animais. Um estudo de pequena escala já indicou um rendimento razoável de proteínas em uma mídia baseada em plantas. O trabalho apresentado aqui é facilmente escalável para a produção final GMP como demonstrado com um candidato a vacina contra a malária, FMP01416. Esta produção de grande escala FMP014-SAPN incluiu tanto a troca aniónica e as etapas de troca catiónica para reduzir ainda mais LPS e Ni2 + conteúdo do produto final. Este SAPN bacteriano-expressado foi aumentado já para um próximo ensaio clínico de fase 1/2a.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por um acordo cooperativo (W81XWH-11-2-0174) entre a Fundação Henry M Jackson para o avanço da medicina militar, Inc., e o departamento de defesa dos EUA. O anticorpo anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV foi recebido do Dr. Susan Zolla-Pazner através do programa de reagente de AIDS da NIH.
10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |