トリマーエピトーププレゼンテーションを必要とするワクチンに対する大腸菌の自己組織化タンパク質ナノ粒子の産生

1.大腸菌BL21(DE3)におけるSHB-SAPNタンパク質の発現 メーカーの指示に従って、2L無菌ガラスアーレンマイヤーフラスコに培地中の成分Aと5mLの成分Bを95mL混合してください(材料の表を参照)。100 μg/mL の最終濃度にアンピシリンを追加します。 以前に確立されたグリセロールストック培養から大腸菌でメディアを接種します。30°Cで培養し、毎分200回転(rpm)で48時間振ります。注:使用した大腸菌BL21(DE3)ストックは、SHB-SAPN遺伝子を有するアンピシリン耐性発現ベクター23を含んでいた。メディアの一般的なプロトコルは37°Cで24時間のインキュベーションを推奨していますが、30°Cでのインキュベーションの48hはSHB-SAPNに対して高い収率を与えました。 培養物を2本の50mL円錐管に移します。4°Cの固定角度ローターで10分間4,000 x gでチューブを遠心分離します。上清を取り出し、ペレットを保存して細胞を収穫します。注:細胞ペレットは、使用するまですぐに処理するか、-80°Cで凍結することができます。 2. 超音波処理による大腸菌BL21(DE3)の分解 注:還元剤として少なくとも30分間250°Cで焼いた非ピロゲンプラスチック製品とガラス製品を使用してください。表示された抗原にS-S結合が含まれている場合、このプロトコル中にTCEPがバッファーに必要です。SHB-SAPN コアのみの場合、バッファー内に TCEP が存在することは必須ではありません。 イミダゾールフリーバッファー(8M尿素、50mMリン酸ナトリウムモノベーシック、20mMトリスベース、5mM TCEP)pH 8.0(5 N NaOHで調整)を調製し、0.22 μm真空ボトルろ過ユニットを使用して濾過します。 1つの50 mL円錐管にイミダゾールフリーバッファーの40 mLでペレット化した細胞(ステップ1.3から)を再中断します。150 Wの超音波処理出力で5分間(超音波処理の4s、残りの6s)氷上のプローブで再懸濁した細胞を超音波処理します。 固定角ローターで25分間、4°Cで29,000 x gで細胞リサート(40mL)を遠心分離し、透明な上清を生成します。上清を150mLの無菌フラスコに移し、ペレットを捨てます。イミダゾールフリーバッファーを用いて上清を100mLに希釈する(後に「サンプル」と呼ばれるプロトコルで)。注:この希釈ステップは、カラムのリサートロード中にFPLCシステム圧力が高くなりすぎないようにするために必要です。 3. ヒスカラムを用いたタンパク質精製 注:このプロトコルはFPLC装置を使用して行われましたが、重力の流れに適応することができます。 以下のバッファを準備し、0.22 μm真空ボトルろ過ユニットを使用してそれらをフィルタリング: (i) イミダゾールフリーバッファ「バッファーA」(8M尿素、50mMリン酸ナトリウムモノベーシック、20 mMトリスベース、5 mM TCEP)pH 8.0;(ii) 500 mM イミダゾールバッファー 「バッファーB」(8M尿素、50mMリン酸ナトリウムモノベーシック、20mMトリスベース、5mM TCEP、500mMイミダゾール) pH 8.0;(iii) イソプロパノール洗浄 (20 mMトリス, 60% イソプロパノール) pH 8.0.注:各バッファのpHを5N NaOHで調整した。 主の列を平衡化する。注: ラボスケールの生産では、このプロトコルは 5 mL のプリパックされた His 列を使用しますが、より大きなサイズのカラムを使用できます。 FPLC ソフトウェアを開き、[新しい方法]オプションをクリックします。[メソッド設定]メニューがすぐに開きます。列位置のドロップダウン メニューの下で、C1ポート 3を選択します。 [技術による表示]ドロップダウン メニューでアフィニティを選択します。列タイプのドロップダウンメニューでは、他の、ヒストラップHP、5 mLを選択します。列の容積および圧力箱は自動的に適切な値に設定される。 [メソッドのアウトライン]ボタンをクリックします。フェーズライブラリポップアップメニューから次のボタンをドラッグします:平衡化、サンプルアプリケーション、カラムウォッシュ、および溶出は、その正確な順序で矢印の横にあります。フェーズライブラリメニューを閉じます。 平衡ボタンをクリックします。表に示す値は、「初期バッファーB」(4%)、「最終バッファーB」(4%)、「ボリューム(CV)」5である必要があります。 [サンプルアプリケーション] ボックスをクリックします。サンプルローディングボックスで、サンプルポンプ付きのカラムにサンプルを注入するためのラジオボタンをクリックします。[メソッド設定から流量を使用] ボックスの横にあるボックスが、システム ポンプ ボックスを使用したサンプルインジェクションでチェックされていることを確認します。画面の右側にある音量ボックスの横にある値を20 mLに変更します。 コラムの洗浄ボタンをクリックします。表に示す値は、「初期バッファーB」(4%)、「最終バッファーB」(4%)、「ボリューム(CV)」5である必要があります。分数収集スキームの横にある [有効にする] ボックスをクリックします。 溶出ボタンをクリックします。表に示す値は、「初期バッファー B」0%、「最終バッファー B」100%、および「ボリューム (CV)」5) である必要があります。分数収集スキームの横にある [有効にする] ボックスをクリックします。[方法設定から分数サイズを使用] をクリック解除し、下の入力ボックスで分数サイズを 4 mL に調整します。 ソフトウェアの上部にある[保存]ボタンをクリックします。ファイルに「平衡」という名前を付けます。 5 mL の事前梱包済みの His カラムを FPLC の対応する列ポート 3 に接続します。ポンプAとポンプBチューブの両方だけでなく、サンプルポンプチューブは、0.22 μm濾過脱イオン水に配置する必要があります。平衡化プログラムを実行します。 ポンプAとポンプBの両方をイミダゾールフリーバッファ(バッファA)に入れ、平衡化プロトコルを再度実行します。 サンプルをカラムに結合し、タンパク質を精製します。FPLC ソフトウェアを開き、[新しい方法]オプションをクリックします。[メソッド設定]メニューがすぐに開きます。列位置のドロップダウン メニューの下で、C1ポート 3を選択します。[技術による表示]ドロップダウン メニューでアフィニティを選択します。列タイプのドロップダウンメニューでは、他の、ヒストラップHP、5 mLを選択します。列の容積および圧力箱は自動的に適切な値に設定される。 [メソッドのアウトライン]ボタンをクリックします。フェーズライブラリポップアップメニューからボタンをドラッグします:平衡化、サンプルアプリケーション、カラムウォッシュ(ウォッシュ1)、カラムウォッシュ(ウォッシュ2)、カラムウォッシュ(ウォッシュ3)、および矢印の横の溶出正確な順序。フェーズライブラリメニューを閉じます。 均衡ボタンをクリックします。表に示す値は、「初期バッファーB」4%、「最終バッファーB」4%、「ボリューム(CV)」5である必要があります。 [サンプルアプリケーション] ボックスをクリックします。サンプルローディングボックスで、サンプルポンプ付きのカラム上のサンプルのラジオボタンをクリックします。[メソッド設定から流量を使用] ボックスの横にあるボックスが、システム ポンプ ボックスを使用したサンプルインジェクションでチェックされていることを確認します。 画面右側の音量ボックスの横で、値を 100 mL に変更します。分数収集スキームの横にある [有効にする] ボタンをクリックします。[方法設定] ボックスから [分数サイズを使用] をクリック解除し、分数サイズを 4 mL に変更します。 最初の列の洗浄ボタン(ウォッシュ1)をクリックします。表に示す値は、「初期バッファー B」4%、「最終バッファー B」4%、「ボリューム(CV)」10) である必要があります。分数収集スキームの横にある [有効にする] ボックスをクリックします。[方法設定から分数サイズを使用] をクリック解除し、分数サイズを 4 mL に変更します。 2列目の洗浄ボタン(ウォッシュ2)をクリックします。表に示す値は、「初期バッファー B」0%、「最終バッファー B」0%、「ボリューム(CV)」5) である必要があります。分数収集スキームの横にある [有効にする] ボックスをクリックします。[方法設定から分数サイズを使用] をクリック解除し、分数サイズを 4 mL に変更します。 3列目の洗浄ボタン(ウォッシュ3)をクリックします。表に示す値は、「初期バッファー B」0%、「最終バッファー B」0%、「ボリューム(CV)」5) である必要があります。分数収集スキームの横にある [有効にする] をクリックします。[方法設定] ボックスから [分数サイズを使用] をクリック解除し、分数サイズを 4 mL に変更します。 [溶出]ボタンをクリックします。表の右にある情報をクリックし、表示されるメニューで [削除] ステップをクリックします。アイソクラティック グラデーション ボタンをテーブルの上に 2 回ドラッグして、2 つのエントリが表示されます。 最初のエントリの値は、「初期バッファー B」30%、”最終バッファー B” 30%、および “ボリューム (CV)” 10 を読み取る必要があります。2 番目のエントリの値は、「初期バッファー B」100%、”最終バッファー B” 100%、および “ボリューム (CV)” 10 を読み取る必要があります。分数収集スキームの横にある [有効にする] ボタンをクリックします。[メソッド設定から分数サイズを使用する]の横にあるボックスをクリックします。 ソフトウェアの上部にある [名前を付けて保存]ボタンをクリックします。ファイルに”浄化”という名前を付けます。ポンプBチューブは500 mMイミダゾールバッファに配置する必要がありますが、FPLCのチューブはイミダゾールフリー洗浄バッファーに入れるべきです。サンプルポンプチューブは、100 mLサンプルに配置する必要があります。 「精製」プログラムを実行し、60%のイソプロパノールが必要な時間を待ちます(ウォッシュ2)。プログラムを一時停止し、イミダゾールフリーウォッシュから60%イソプロパノール洗浄にポンプAチューブを移動します。プログラムを再起動します。 イソプロパノールステップが完了したら、プログラムをもう一度一時停止し、ポンプAチューブをイミダゾールフリーの洗浄バッファーに戻します。浄化プログラムを再起動します (残りの実行は自動化されます)。 4. SDS-PAGEによる純度評価とタンパク質同定 (i)フロースルー(主のカラムに結合しなかった細胞溶化物)、(ii)ウォッシュ1、(iii)ウォッシュ3(60%イソプロパノール洗浄)、および(iv)洗浄3に対応するすべての画分を別々の50mL円錐管に組み合わせます。溶出ステップから2 mL分画を組み合わせないようにしてください。 プールされた各画分と溶出ステップから15μLを0.5mLマイクロ遠心管に2x Laemmliサンプルバッファーで混合し、95°Cで10分間変性させます。 タンパク質が変性する間、1xトリスグリシンSDS-PAGEランニングバッファーに3つの汚れのない4〜20%プレキャストポリアクリルアミドゲルを有するゲル走行装置をセットアップする。 最初のウェルに分子量マーカーの8 μLをロードし、ゲルの他のウェルに変性サンプルの30 μLをロードします。染料の前部がゲルの底に当たるまで200Vでゲルを実行します(約30分)。装置からゲルを取り出し、脱イオン水で簡単にすすいでください。染色のないイメージングシステムを使用して、すぐにゲルを画像化します。 正しいサイズ(18.07 kDa)のタンパク質バンドを含む分数を特定します。これらすべての分数をプールします。 5. ウェスタンブロットによるタンパク質同定 His特異的抗体(抗6x HisTag)およびSHB特異的抗体(167-D-IV)を用いてウェスタンブロットを実行し、精製された全長タンパク質を同一性にする。抗6x HisTag抗体は、タンパク質のN終所を認識し、167-D-IV抗体は、全長タンパク質の存在を実証するC終所を認識する。 (i)フロースルー、(ii)ウォッシュ1、(iii)ウォッシュ2(60%イソプロパノール洗浄)、(iv)ウォッシュ3、および280nmの吸光度で分光計器を用いて溶出工程からのすべての分画を決定する。これらの各群のイミダゾールフリーバッファーの15 μLに100ngのタンパク質を含む希釈物を生成する。 サンプルの各15 μLに2x Laemmliサンプルバッファーの15 μLを追加し、ステップ4.1のようにそれらを変性します。脱伝が完了したら、すべてのタンパク質を確実に転移させるためにチューブをスピンダウンします。 サンプルと染色前のマーカーを、汚れのない4~20%プレキャストポリアクリルアミドゲルにロードします。色素の前部がゲルの底に達するまで200Vで電気泳動を実行します。 ゲルが走っている間、TBS-Tの1L(20 mMトリス、150mM NaCl、0.1%トゥエン20)とTBS-Tで5%の非脂肪牛乳の200mLを作ります。 ウェスタンブロット転写システムを使用して、タンパク質をニトロセルロース膜に転写します。組み立て済みの転送スタックを使用し、その上にゲルを配置します。7分間25Vで実行するようにシステムをセットアップします。注:後続のすべてのステップは、室温(RT)で100 rpmに設定された軌道シェーカー上で実行されます。 転送が完了したら、TBS-Tで2回10分間ブロットを洗浄します。 TBS-Tで5%の非脂肪牛乳でニトロセルロース膜(ブロット)を少なくとも1時間ブロックし、TBS-Tで2回10分間洗浄します。 一次167-D-IVおよび抗6x HisTag抗体をTBS-T(ストックAb)で1mg/mLに希釈する。TBS-Tの20mLを含む2つの異なるチューブにストック167-D-IVの2μLと4μLのストック抗6x HisTag抗体を添加することにより、167-D-IV 10,000倍および抗6倍HisTag 5,000倍のストックアブを希釈する。一次抗体の総量20mLを各ブロットに1つずつ加え、1時間ブロットをTBS-Tで2回10分間洗浄します。 TBS-Tの20mLでアルカリホスファターゼと結合したマウス抗ヒト二次抗体の1mg/mLの希釈4μL(1:5,000希釈)。ヤギ抗マウス二次抗体の1mg/mLの希釈4 μLをTBS-Tの20mLでアルカリホスファターゼと結合した(1:5,000希釈)。対応するブロットに二次抗体を追加します。注:抗ヒト二次抗体は167-Dに結合し、抗マウスは抗6x HisTagに結合する。TBS-Tで2回10分間ブロットを洗浄します。 ブロットを覆うのに十分なBCIP/NBTアルカリホスファターゼ基板を加えます。バンドが現れるまで約10分間ブロットを開発します。冷たい水道水でブロットを洗い流し、フラットベッドスキャナでスキャンする前に乾燥させます。 6. SHB-SAPNの折りたたみ プールされたタンパク質(合計10\u201220 mL)を透析カセットを遮断し、8M尿素、20mMトリス、5%グリセロール、5mM TCEP pH 8.5(一晩18\u201226°C)に透析します。 透析バッファー内の尿素濃度を2時間毎に2Mずつ段階的に減少させることにより、試料から尿素をゆっくりと透析させる。尿素濃度2Mで、透析装置を4°Cに移動します(この工程から透析バッファーにTCEPを使用しないでください)。120 mM尿素、20 mMトリス、5%グリセロール、pH 8.5を一晩4°Cに透析して再折りたたみを完了します。 再折り畳まれたタンパク質(SHB-SAPN)を透析カセットから取り除きます。0.22 μm ポリビニリジンフッ化物(PVDF)シリンジファイラーを使用してSHB-SAPNをフィルタリングします。アリコートSHB-SAPNを無菌チューブに入れ、-80°Cで凍結し、その後の分析のためにRTで少なくとも100 μLを残します。 7. サイズと外観による粒子の検証 動的光散乱(DLS) SHB-SAPNの平均粒径を次のパラメータで測定する:材料としてタンパク質を選択し、120 mM尿素、20 mMトリス、5%グリセロール25°Cの複雑なバッファーを作成し、分析のために使い捨てキュベットを選択し、自動選択測定、5回の実行に設定します。 使い捨てキュベットにSHB-SAPNの45 μLを追加し、緑色の矢印をクリックしてソフトウェアを実行します。読み出しのパーセンテージ ボリュームを選択します。 ナノ粒子追跡解析(NTA) 再折りたたみバッファーでサンプルを 1:20 で希釈します。希釈したサンプルを10mL作ります。 3 mLシリンジを使用して、NTA計測器を再折りたたみバッファーでフラッシュし、約1.5mLのサンプルをロードして機器を平衡させます。分析には、サンプルの残りの部分を使用します。 [SOP] タブをクリックして、NTA ソフトウェアに新しいSOPを作成します。タブの下でキャプチャの数を3に変更し、キャプチャ時間を30sに変更し、画面の左側にあるオートフォーカスボタンを押してサンプルをフォーカスします。機械の側面にある手動フォーカスノブを使用して、フォーカスを微調整します。 システムがシリンジを使用して少量のサンプルを読み込むプロンプトが表示された場合は、作成した SOP を実行します。システムがすべてのキャプチャを取得すると、自動的に分析画面が表示されます。検出限界バーをスライドさせて、すべての実際のパーティクルに赤い十字が印が付いられるようにします。実行分析ボタンを押すと、解析が自動的に開始されます。 透過電子顕微鏡(TEM) グロー放電フォームバー/カーボン400メッシュ銅TEMサポートフィルム。 0.075 mg/mL濃度で3 μLのサンプルをグリッドに30sのウィックオフフィルターペーパーを使用して液体を取り除きます。 3 μLの脱イオン水でグリッドを3回洗い、毎回フィルターペーパーで水を拭き取ります。 支持フィルムに0.5%のウラニル酢酸の3 μLを加え、30s.ウィックの大部分の酢酸を取り除き、表面に薄いフィルムを残します。透過型電子顕微鏡で画像を撮る前に、サンプルを乾燥させます。 TEM上の80 kVのイメージサンプル。 8. 運動性リムルスアメーボサイトリザート(LAL)アッセイを用いてサンプル中のエンドトキシンレベルの決定 キットとサンプルを冷蔵庫から取り出し、RTに平衡化します。 このアッセイを行うには、ヒートブロックを備えたプレートリーダーと、37°Cで405nmの波長で40の読み取りのためのサンプルを読み取る能力が必要です。ウェルが 150 s ごとに読み取られるようにプログラム テンプレートを作成して、始点を識別します (OD は最初の読み取りと比較して 0.2 増加します)。 PBSでの免疫用量濃度にサンプルを希釈する。注:再折りたたみバッファーのpHは、LALアッセイの範囲外です。PBSのサンプルの希釈は許容範囲にpHを置く。 50 EU/mLを生成する分析証明書によって決定されるエンドトキシンフリーLAL水の適切な体積でコントロールエンドトキシンを再中断します。積極的にエンドトキシンの完全な再懸濁を確保するために15分間バイアルを渦。 50 EU から 0.005 EU/mL の範囲のガラスバイアルの 10 倍のシリアル希釈を事前に形成することにより、エンドトキシン標準曲線を生成します。希釈ごとに、LAL水の0.9 mLに前の希釈の0.1 mLを追加します。1分間の組み合わせ後に激しく渦。 標準曲線希釈と SHB-SAPN サンプルを 96 ウェルプレートに複製して追加します。重複時にもLAL水を負のコントロールとして使用してください。プレートを37°Cで15分間前置きします。 インキュベーションの終わりに向かって、LAL水の2.6 mLでアッセイ試薬バイアルを再中断します。血清学的なピペットと内容を穏やかに混合する。 96ウェルプレートの各ウェルに100μLのアッセイ試薬を加えます。プレートをプレートリーダーに素早く移動し、ステップ8.2で書かれたプログラムテンプレートを実行します。 プログラムが完了したら、コントロールの対数値と始点時刻のログ値を使用して標準曲線を生成します。この曲線から生成された式を使用して、サンプル中のエンドトキシン濃度を計算します。