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Bioengineering

Produzione di Nanoparticelle proteiche auto-assemblanti E. coliper vaccini che richiedono la presentazione dell'epitoscopio trimerico

Published: August 21, 2019
doi:
10.3791/60103
, , ,
1U.S. Military HIV Research Program,Walter Reed Army Institute of Research, 2Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, 3Alpha-O Peptides AG

Summary

Un metodo dettagliato è fornito qui che descrive la purificazione, il ripiegamento e la caratterizzazione delle nanoparticelle proteiche auto-assemblanti (SAPN) da utilizzare nello sviluppo del vaccino.

Abstract

Le nanoparticelle proteiche auto-assemblanti (SAPN) funzionano come display di antigene ripetitivo e possono essere utilizzate per sviluppare un’ampia gamma di vaccini per diverse malattie infettive. In questo articolo viene illustrato un metodo per produrre un nucleo SAPN contenente un assembly di fascio di sei elica (SHB) in grado di presentare gli antigeni in una conformazione trimerica. Descriviamo l’espressione della SHB-SAPN in un sistema E. coli, così come le necessarie fasi di purificazione delle proteine. Abbiamo incluso un passaggio di lavaggio isopropanolo per ridurre il lipopolisicoaccharide batterico residuo. Come indicazione dell’identità e della purezza delle proteine, la proteina ha reagito con anticorpi monoclonali noti nelle analisi delle macchie occidentali. Dopo la ripiegamento, la dimensione delle particelle è diminuita nell’intervallo previsto (20-100 nm), che è stato confermato dalla dispersione dinamica della luce, dall’analisi del monitoraggio delle nanoparticelle e dalla microscopia elettronica a trasmissione. La metodologia qui descritta è ottimizzata per SHB-SAPN, tuttavia, con solo lievi modifiche può essere applicata ad altri costrutti SAPN. Questo metodo è anche facilmente trasferibile alla produzione su larga scala per la produzione di GMP per vaccini umani.

Introduction

Mentre lo sviluppo tradizionale dei vaccini si è concentrato sugli agenti patogeni inattivati o attenuati, l’attenzione dei vaccini moderni si è spostata verso i vaccini delle sottounità1. Questo approccio può portare a una risposta più mirata e potenzialmente a i candidati al vaccino più efficaci. Tuttavia, uno dei principali inconvenienti è che i vaccini delle sottounità non sono particolati come organismi interi che possono portare a una ridotta immunogenicità2. Una nanoparticella come sistema di visualizzazione antigene ripetitivo può avere i benefici sia dell’approccio mirato al vaccino delle sottounità sia della natura del particolato dell’intero organismo1,3.

Tra i tipi esistenti di nanovaccino, le assemblee proteiche progettate razionalmente consentono la progettazione e lo sviluppo di candidati vaccino in grado di presentare più copie dell’antigene potenzialmente in una conformazione nativa1,4 ,5,6. Un esempio di questi gruppi proteici sono le nanoparticelle proteiche auto-assemblanti (SAPN)7. I SAPN si basano su domini a bobina e sono tradizionalmente espressi in Escherichia coli8. I candidati al vaccino SAPN sono stati sviluppati per una varietà di malattie come la malaria, la SARS, l’influenza, la toxoplasmosi e l’HIV-19,10,11,12,13 , 14 Del sistema , 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19. La progettazione di ciascun candidato SAPN è specifica per l’agente patogeno di interesse, tuttavia, le tecniche di produzione, purificazione e ripiegamento sono generalmente ampiamente applicabili.

Uno dei nostri interessi attuali è un vaccino efficace per l’HIV-1. In RV144, l’unico studio clinico di fase III di un vaccino HIV-1 che ha dimostrato una modesta efficacia, il ridotto rischio di infezione è stato correlato con gli anticorpi IgG al ciclo V1V2 della proteina dell’involucro20,21. La presentazione trimeric nativa di questa regione è pensata per essere importante per l’immunogenicità protettiva22. Per presentare il circuito V1V2 il più vicino possibile alla conformazione nativa, abbiamo sviluppato una prova di principio del candidato del vaccino SAPN che conteneva l’involucro HIV-1 del pacchetto di sei elicoivi (SHB) per presentare il circuito V1V2 nella corretta conformazione9 . Questo candidato è stato riconosciuto da noti anticorpi monoclonali alla proteina dell’involucro HIV-1. I topi immunizzati con V1V2-SHB-SAPN hanno sollevato anticorpi specifici V1V2, che, soprattutto, sono legati a gp70 V1V2, l’epitope conformazionale 9. Il core SHB-SAPN potrebbe avere altre funzioni oltre il ruolo di vettore per il ciclo HIV-1 V1V2. Qui viene descritta una metodologia dettagliata per l’espressione, la purificazione, la ripiegatura e la convalida del core SHB-SAPN. La selezione della sequenza, la progettazione delle nanoparticelle, la clonazione molecolare e la trasformazione di E. coli sono state descritte in precedenza9.

Protocol

1. Espressione della proteina SHB-SAPN in E. coli BL21(DE3) Mescolare 95 mL del componente A e 5 mL del componente B del supporto in un pallone Erlenmeyer in vetro sterile 2 L secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei Materiali). Aggiungete l’ampicillina ad una concentrazione finale di 100 g/mL. Inoculare i media con E. coli da una cultura dello stock di glicerolo precedentemente stabilita. Incubare la coltura a 30 s con agitazione a 200 rotazioni al minuto (rpm) per 48 h.NOTA: Lo stock e. coli BL21 (DE3) usato conteneva il vettore di espressione resistente all’annicillina23 con il gene SHB-SAPN. Anche se il protocollo generale dei media raccomanda 24 h di incubazione a 37 , 48 h di incubazione a 30 gradi centigradi ha dato una maggiore resa per SHB-SAPN. Trasferire la coltura a due tubi conici da 50 mL. Centrifugare i tubi a 4.000 x g per 10 min con un rotore ad angolo fisso a 4 gradi centigradi. Rimuovere il supernatante e salvare il pellet per raccogliere le cellule.NOTA: Il pellet cellulare può essere elaborato immediatamente o congelato a -80 gradi centigradi fino all’uso. 2. Lisi di E. coli BL21(DE3) per sonicazione NOTA: Utilizzare plasticware non pirogeni cialde e bicchieri cotti a 250 gradi centigradi per almeno 30 minuti. TCEP è necessario nei buffer durante questo protocollo se l’antigene visualizzato contiene obbligazioni S-S. Solo per il core SHB-SAPN, la presenza di TCEP nei buffer non è essenziale. Preparare il buffer senza imidazole (8 M Urea, 50 mM di fosfato di sodio monobasic, base 20 mM Tris, 5 mM TCEP) pH 8.0 (regolato con 5 N NaOH) e filtrarlo utilizzando un’unità di filtrazione della bottiglia sottovuoto da 0,22 m. Risospendere le celle pellettate (dal punto 1.3) con 40 mL di buffer senza imidazole in un tubo conico da 50 mL. Sonicare le cellule risospese con una sonda sul ghiaccio per 5 min (4 s di sonicazione, 6 s di riposo) con una produzione di sonicazione di 150 W. Centrifugare il lisato cellulare (40 mL) a 29.000 x g a 4 gradi centigradi per 25 min in un rotore ad angolo fisso per generare un soldabile chiarificato. Trasferire il supernatante in una fiaschetta sterile da 150 mL e scartare il pellet. Diluire la supernata a 100 mL utilizzando il buffer privo di imidazole (più avanti nel protocollo denominato “campione”).NOTA: Questa fase di diluizione è necessaria per evitare che la pressione del sistema FPLC diventi troppo elevata durante il caricamento lisato sulla colonna. 3. Purificazione delle proteine con una colonna His NOTA: questo protocollo è stato eseguito utilizzando uno strumento FPLC, ma può essere adattato al flusso di gravità. Preparare i seguenti buffer e filtrarli utilizzando un’unità di filtrazione per bottiglie sottovuoto di 0,22 m: (i) buffer senza imidazole “Buffer A” (8 M Urea, 50 mM di fosfato di sodio monobasic, base Tris da 20 mM, 5 mM TCEP) pH 8,0; ii) 500 mM imidazole buffer “Buffer B” (8 M Urea, 50 mM fosfato di sodio monobasico, 20 mM Tris base, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazole) pH 8.0; e (iii) lavaggio isopropanolo (20 mM Tris, 60% isopropanolo) pH 8.0.NOTA: il pH per ogni buffer è stato regolato con 5 N NaOH. Equilibrate la Sua-colonna.NOTA: per la produzione su scala di laboratorio, questo protocollo utilizza una colonna His preconfezionata da 5 mL, ma è possibile utilizzare qualsiasi colonna di dimensioni maggiori. Aprire il software FPLC e fare clic sull’opzione Nuovo metodo. Si aprirà immediatamente al menu delle impostazioni del metodo. Nel menu a discesa per la posizione della colonna scegliere Porta C1 3. Nel menu a discesa Mostrato per tecnica scegliere affinità. Nel menu a discesa Tipo di colonna scegliere altri, Histrap HP, 5 mL. Il volume della colonna e le caselle di pressione verranno impostati automaticamente sui valori appropriati. Fare clic sul pulsante Contorno metodo. Trascinare i pulsanti seguenti dal menu a comparsa Libreria di fasi: equilibration, sample application, column washe eluiion accanto alla freccia in quell’ordine esatto. Chiudere il menu Libreria fase. Fare clic sul pulsante equilibrato. I valori elencati nella tabella devono essere “buffer iniziale B” (4%), “buffer finale B” (4%) e “volume (CV)” 5. Fare clic sulla casella Applicazione di esempio. Nella casella di caricamento di esempio fare clic sul pulsante di opzione per Inject sample on column with sample pump. Assicurarsi che la casella accanto alla casella Usa portata dalle impostazioni del metodo sia selezionata nella casella iniezione di esempio con pompa di sistema. Accanto alla casella del volume sul lato destro dello schermo modificare il valore in 20 mL. Fare clic sul pulsante Lavaggio colonna. I valori elencati nella tabella devono essere “buffer iniziale B” (4%), “buffer finale B” (4%) e “volume (CV)” 5. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fate clic sulla casella Abilita. Fare clic sul pulsante di elusione. I valori elencati nella tabella devono essere “buffer iniziale B” 0%, “buffer finale B” 100% e “volume (CV)” 5. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic sulla casella Abilita. Deselezionare le impostazioni Usa dimensione frazione dal metodo e regolare la dimensione della frazione a 4 mL nella casella di riempimento sottostante. Fare clic sul pulsante Salva con nome nella parte superiore del software. Assegnare al fascicolo il nome “equilibration”. Collegare una colonna His preconfezionata da 5 mL alla porta di colonna 3 corrispondente in FPLC. Sia la pompa A e pompa B tubi così come il tubo pompa campione deve essere collocato in 0,22 m acqua filtrata deionizzata. Eseguire il programma di equilibratione. Posizionare sia la pompa A che la pompa B, sia il tubo della pompa del campione nel buffer senza imidazole (Buffer A) ed eseguire nuovamente il protocollo di equilibratione. Legare il campione alla colonna e purificare la proteina.Aprire il software FPLC e fare clic sull’opzione Nuovo metodo. Si aprirà immediatamente al menu delle impostazioni del metodo. Nel menu a discesa Posizione colonna scegliere Porta C1 3. Nel menu a discesa Mostrato per tecnica scegliere affinità. Nel menu a discesa tipo di colonna scegliere altri, Histrap HP, 5 mL. Il volume della colonna e le caselle di pressione verranno impostati automaticamente sui valori appropriati. Fare clic sul pulsante Contorno metodo. Trascinare i pulsanti dal menu a comparsa Libreria di fasi: equilibratione, applicazione di esempio, lavaggio colonna (Lavaggio 1), lavaggio colonna (Lavaggio 2), lavaggio colonna (Wash 3) e Elusione accanto alla freccia in tale l’ordine esatto. Chiudere il menu Libreria fase. Fare clic sul pulsante Equilibration. I valori elencati nella tabella devono essere “buffer iniziale B” 4%, “buffer finale B” 4% e “volume (CV)” 5. Fare clic sulla casella Applicazione di esempio. Nella casella di caricamento dell’esempio fare clic sul pulsante di opzione per Inject sample nella colonna con sample pump. Assicurarsi che la casella accanto alla casella Usa portata dalle impostazioni del metodo sia selezionata nella casella iniezione di esempio con pompa di sistema. Accanto alla casella del volume sul lato destro dello schermo modificare il valore in 100 mL. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic sul pulsante Abilita. Deselezionare la casella Usa dimensione frazione dalle impostazioni del metodo, quindi modificare la dimensione della frazione in 4 mL. Fare clic sul primo pulsante di lavaggio colonna (Lavaggio 1). I valori elencati nella tabella devono essere “buffer iniziale B” 4%, “buffer finale B” 4% e “volume (CV)” 10. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic sulla casella Abilita. Deselezionare le impostazioni Usa dimensione frazione dal metodo e quindi modificare la dimensione della frazione in 4 mL. Fare clic sul pulsante di lavaggio della seconda colonna (Wash 2). I valori elencati nella tabella devono essere “buffer iniziale B” 0%, “buffer finale B” 0% e “volume (CV)” 5. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic sulla casella Abilita. Deselezionare le impostazioni Usa dimensione frazione dal metodo e quindi modificare la dimensione della frazione in 4 mL. Fare clic sul pulsante di lavaggio della terza colonna (Wash 3). I valori elencati nella tabella devono essere “buffer iniziale B” 0%, “buffer finale B” 0% e “volume (CV)” 5. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic su Abilita. Deselezionare la casella Usa dimensione frazione dalle impostazioni del metodo, quindi modificare la dimensione della frazione in 4 mL. Fare clic sul pulsante Eluzione. Nella tabella fare clic con il pulsante destro del mouse sulle informazioni elencate e scegliere Elimina passaggio dalmenu visualizzato . Trascinate due volte il pulsante della sfumatura isocratica sulla tabella, in modo che siano presenti due voci. Il valore della prima voce dovrebbe essere “buffer iniziale B” 30%, “buffer finale B” 30% e “Volume (CV)” 10. Il valore per la seconda voce dovrebbe leggere “buffer iniziale B” 100%, “buffer finale B” 100% e “volume (CV)” 10. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic sul pulsante Abilita. Fare clic sulla casella accanto a Usa dimensione frazione dalle impostazioni del metodo. Fare clic sul pulsante Salva con nome nella parte superiore del software. Assegnare al file il nome “purificazione”. Pompa Un tubo del FPLC deve essere inserito nel buffer di lavaggio senza imidazole mentre il tubo B pompa deve essere inserito nel buffer imidazole 500 mM. Il tubo della pompa del campione deve essere inserito nel campione da 100 mL. Eseguire il programma di “purificazione” e attendere il tempo in cui è necessario il 60% dell’isopropanolo (Lavaggio 2). Mettere in pausa il programma, spostare la pompa Un tubo dal lavaggio senza imidazole nel 60% lavaggio isopropanolo. Riavviare il programma. Una volta completato il passo isopropanolo, mettere in pausa il programma di nuovo e spostare pompa A tubing di nuovo nel buffer di lavaggio senza imidazole. Riavviare il programma di purificazione (il resto della corsa è automatizzato). 4. Valutazione della purezza e identificazione delle proteine da parte di SDS-PAGE Combinare tutte le frazioni corrispondenti a (i) flow-through (il lisato di cella che non si legava alla colonna Sua), (ii) Lavare 1, (iii) Lavare 3 (60% lavaggio isopropanolo), e (iv) Lavare 3 in tubi conici 50 mL separati. Non combinare le frazioni da 2 mL dai gradini di eluizione. Mescolare 15 l da ciascuna delle frazioni raggruppate e tutte le frazioni da gradini di eluizione con 2x buffer campione Laemmli in un tubo di microcentrifuga da 0,5 ml e denaturarli a 95 gradi centigradi per 10 min. Mentre la proteina denatura, impostare l’apparato di funzionamento del gel con 3 gel di poliacrilmina prefabbricato senza macchie nel buffer di corsa 1x Tris-glycine SDS-PAGE. Caricare 8 l di marker di peso molecolare al primo pozzo e 30 lun di campione denaturato agli altri pozzi del gel. Eseguire i gel a 200 V fino a quando il colorante anteriore colpisce il fondo del gel (circa 30 min). Rimuovere i gel dall’apparecchio e risciacquare brevemente con acqua deionizzata. Immagine immediata del gel utilizzando il sistema di imaging privo di macchie. Identificare le frazioni che contengono bande proteiche con la dimensione corretta (18,07 kDa). Piscina tutte queste frazioni. 5. Identificazione delle proteine per macchia occidentale Eseguire una macchia occidentale utilizzando un anticorpo specifico del Suo (anti-6x HisTag) e un anticorpo specifico SHB (167-D-IV) per identificare la proteina a lunghezza intera purificata. L’anticorpo anti-6x HisTag riconosce il capolinea N della proteina e l’anticorpo 167-D-IV riconosce il capolinea C dimostrando la presenza della proteina a lunghezza intera. Determinare la concentrazione proteica del (i) flow-through, (ii) Lavare 1, (iii) Lavaggio 2 (60% lavaggio isopropanolo), (iv) Lavaggio 3, e tutte le frazioni dai gradini di eluizione con lo strumento spettrotrometro ad un assorbimento di 280 nm. Generare diluizioni che contengono 100 ng di proteine in 15 Litri di buffer senza imidazoli per ciascuno di questi gruppi. Aggiungete 15 l of lacemmli da 1x di laemmli a ciascuno dei 15 l e denaturateli come al punto 4.1. Una volta completata la negazione, i tubi si abbassano per garantire che tutte le proteine possano essere trasferite. Caricare i campioni e il pennarello precolorato in un gel di poliacrilammide prefabbricato privo di macchie 4-20%. Eseguire l’elettroforesi a 200 V fino a quando la parte anteriore del colorante raggiunge il fondo del gel. Mentre il gel viene eseguito, fare 1 L di TBS-T (20 mM, 150 mM NaCl, e 0.1% Tween 20) e 200 mL di 5% di latte non grasso in TBS-T. Utilizzare un sistema di trasferimento di macchie occidentali per trasferire proteine su una membrana di nitrocellulosa. Utilizzare una pila di trasferimento preassemblata e posizionare il gel su di esso. Impostare il sistema in modo che funzioni a 25 V per 7 min. Verificare la presenza del marcatore pre-colorato sulla membrana di nitrocellulosa che indica un trasferimento completo.NOTA: Tutti i passaggi successivi vengono eseguiti su uno shaker orbitale fissato a 100 giri/min a temperatura ambiente (RT). Una volta completato il trasferimento, lavare le macchie due volte con TBS-T per 10 min ciascuno. Bloccare le membrane di nitrocellulosa (macchia) con 5% di latte non grasso in TBS-T per almeno 1 h. Lavare le macchie due volte con TBS-T per 10 min ciascuno. Diluire gli anticorpi primari 167-D-IV e HisTag anti-6x a 1 mg/mL in TBS-T (stock Ab). Diluire lo stock Abs degli anticorpi 167-D-IV 10.000-fold e anti-6x HisTag 5.000-fold aggiungendo 2 -L dello stock 167-D-IV e 4 L dello stock anti-6x HisTag anticorpi a due tubi diversi contenenti 20 mL di TBS-T. Aggiungere il volume totale di 20 mL di anticorpi primari, uno per ogni macchia, e incubare le macchie per 1 h. Lavare le macchie due volte con TBS-T per 10 min. Diluire 4 -L di 1 mg/mL dell’anticorpo secondario anti-umano del topo coniugato con fosfofano alcalina in 20 mL di TBS-T (1:5.000 diluizione). Diluire 4 -L di 1 mg/mL dell’anticorpo secondario antitocapra coniugato con fosfatosi alcalino in 20 mL di TBS-T (1:5.000 diluizione). Aggiungere anticorpi secondari alle macchie corrispondenti.NOTA: L’anticorpo secondario anti-umano si lega a 167-D e l’anti-mouse si lega all’anti-6x HisTag. Lavare le macchie due volte con TBS-T per 10 min. Aggiungere abbastanza BCIP/NBT substrato alfosasi per coprire le macchie. Sviluppare le macchie per circa 10 minuti fino a quando non appaiono le bande. Risciacquare le macchie con acqua fredda del rubinetto e lasciarle asciugare prima della scansione con uno scanner piano. 6. Ripiegamento di SHB-SAPN Aggiungete la proteina di accumulo (10-u201220 mL totale) a un peso molecolare di 10 kDa tagliato fuori cassetta dialisi e dialitare in 8 M urea, 20 mM Tris, 5% glicerol, 5 mM TCEP pH 8,5 a RT (18-u201226 C) durante la notte. Dialze lentamente l’urea fuori dal campione diminuendo la concentrazione di urea nel buffer di dialisi passo saggio di 2 M ogni 2 h. Ad una concentrazione di urea di 2 M, spostare l’apparato di dialisi a 4 gradi centigradi (non utilizzare TCEP nel tampone di dialisi da questo passaggio). Terminare la ripiegamento dilatando il campione in urea da 120 mM, 20 mM Tris, 5% glicerolo, pH 8,5 a 4 gradi durante la notte. Rimuovere la proteina ripiegata (SHB-SAPN) dalla cassetta di dialisi. Filtrare il filetto di siringa di polivinylidene (PVDF) da 0,22 m. Aliquota-SAPN in tubi sterili e congelarli a -80 gradi centigradi, lasciando almeno 100 gradi a RT per le successive analisi. 7. Convalida delle particelle in base alle dimensioni e all’aspetto Dispersione dinamica della luce (DLS) Misurare la dimensione media delle particelle della SHB-SAPN con i seguenti parametri: selezionare la proteina come materiale, creare un buffer complesso per 120 mM di urea, 20 mM Tris, 5% glicerol 25 gradi c per la temperatura, selezionare cuvette usa e getta per l’analisi, selezionare automatico misura, impostata per 5 corse. Aggiungere 45 -L di SHB-SAPN a una cuvette usa e getta ed eseguire il software facendo clic sulla freccia verde. Selezionare il volume percentuale per la lettura. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) Diluire il campione di 1:20 nel buffer di ripiegamento. Fare 10 mL di campione diluito. Utilizzando 3 siringhe mL, svuotare lo strumento NTA con il buffer di ripiegamento e caricare circa 1,5 mL di campione per equilivitare lo strumento. Utilizzare il resto del campione per l’analisi. Creare un nuovo SOP nel software NTA facendo clic sulla scheda SOP. Nella scheda modificare il numero di acquisizioni a 3 e modificare il tempo di acquisizione a 30 s. Premere il pulsante di messa a fuoco automatica sul lato sinistro dello schermo per mettere a fuoco il campione. Utilizzare la manopola di messa a fuoco manuale sul lato della macchina per regolare la messa a fuoco. Eseguire il SOP creato, quando i prompt di sistema caricano un piccolo volume di campione con la siringa. Dopo che il sistema ha preso tutte le catture, verrà visualizzata automaticamente la schermata di analisi. Far scorrere la barra del limite di rilevamento in modo che tutte le particelle reali siano contrassegnate con croci rosse. Premere il pulsante Esegui analisi e l’analisi inizierà automaticamente. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) Pellicole di supporto TEM in rame a faglia di scarico a bagliore/carbonio 400. Aggiungere 3 – L di campione ad una concentrazione di 0,075 mg/mL sulla griglia per 30 s. Wick dal liquido utilizzando una carta da filtro. Lavare la griglia con 3 -L di acqua deionizzata tre volte, ogni volta che spazza via l’acqua con carta da filtro. Aggiungere 3 -L di acetato di uranilo allo 0,5% alla pellicola di supporto e lasciarlo stare per 30 s. Wick fuori la maggior parte dell’acetato di uranilo, ma lasciare una pellicola sottile sulla superficie. Lasciare asciugare i campioni prima di imaging sul microscopio elettronico di trasmissione. Esempi di immagini a 80 kV su un TEM. 8. Determinazione dei livelli di endotossina nei campioni utilizzando un saggio liscito (LAL) di limulus ametoso cinetico Togliere il kit e i campioni dal frigorifero e lasciare che l’equilibrato a RT. Per eseguire questo test, è necessario un lettore di lastre con un blocco di calore e la capacità di leggere i campioni per 40 letture ad una lunghezza d’onda di 405 nm a 37 gradi centigradi. Scrivere un modello di programma in modo che i pozzi vengano letti ogni 150 s per identificare il punto temporale di esordio (l’OD aumentato di 0,2 rispetto alla prima lettura). Diluire il campione per la concentrazione di dose di immunizzazione in PBS.NOTA: il pH del buffer di ripiegamento non rientra nell’intervallo del saggio LAL. La diluizione del campione in PBS imposterà il pH sull’intervallo accettabile. Risospendere l’endotossina di controllo nel volume appropriato dell’acqua LAL senza endotossina, come determinato dal certificato di analisi per generare 50 EU/mL. Vorticare vigorosamente la fiala per 15 minuti per garantire la completa sospensione dell’endotossina. Generare la curva standard dell’endotossina preformando una diluizione seriale di 10 volte in fiale di vetro compresa tra 50 EU e 0,005 EU/mL. Per ogni diluizione, aggiungere 0,1 mL della diluizione precedente a 0,9 mL di acqua LAL. Vortice vigorosamente dopo la combinazione per 1 min. Aggiungere diluizioni curve standard e campioni SHB-SAPN duplicati a una piastra di 96 pozze. Utilizzare l’acqua LAL come controllo negativo anche in duplicato. Preincubare la piastra a 37 gradi centigradi per 15 min. Verso la fine dell’incubazione, risospendere la fiala reagente di prova con 2,6 mL di acqua LAL. Mescolare delicatamente il contenuto con una pipetta sierologica. Aggiungere 100 l del rinnovano di qualità in ogni pozzetto del pozzo 96-bene. Spostare rapidamente la piastra sul lettore di lamiere ed eseguire il modello di programma scritto nel passaggio 8.2. Una volta completato il programma, generare una curva standard utilizzando il valore di log dei controlli rispetto al valore di log del tempo di insorgenza. Utilizzare la formula generata da questa curva per calcolare la concentrazione di endotossina nei campioni.

Representative Results

L’assieme SHB-SAPN completamente assemblato qui si basa sulle sequenze proteiche (Figura 1A) che si prevede si ripieghino in una particella che contiene 60 copie del monomero (Figura 1B). Nella Figura 2 viene fornita una descrizione del metodo per la produzione, la purificazione e l’identificazione del core SHB-SAPN. E. coli da uno stock di glicerolo che conteneva un vettore di espressione pPep-T con sequenza genica del nucleo SHB-SAPN sono stati indotti in BL21 (DE3) E. coli. Le cellule batteriche sono state coltivate e lismi con successo in condizioni di denatura e riduzione. Il lisato totale delle cellule è stato utilizzato per purificare i monomeri SHB-SAPN da FPLC utilizzando una colonna Ni2 s (Figura 3A). Il cromatografo FPLC dimostra che la proteina si è eluita sia a 150 mM che a 500 mM di imidazolo (Figura 3A). Il cromatogramma mostra anche altri due picchi a 185 mL e 210 mL di volume totale corrispondente al lavaggio isopropanolo e al lavaggio senza imidazole, rispettivamente. Le frazioni e la purezza della proteina ricombinante sono state identificate da gel sfumati SDS-PAGE (Figura 3B). La proteina di interesse si trovava principalmente in frazioni 68-u201279 (278-u2012300 mL volume totale). Queste frazioni sono state combinate per ulteriori analisi. La macchia occidentale con anticorpo (N-terminale) e 167-D-IV anticorpo (C-terminus) indicava che le frazioni raggruppate erano effettivamente la proteina di interesse (Figura 4A,B). Queste macchie hanno anche dimostrato la presenza dei multimeri SHB-SAPN. I fuchi e le frazioni di eluizione precedenti tendevano a contenere una maggiore concentrazione di proteine multimerizzate e sono stati quindi esclusi. I campioni che contenevano i monomeri proteici di interesse sono stati ripiegati nella SHB-SAPN completamente assemblata dalla dialisi. La distribuzione delle dimensioni delle particelle è stata determinata dall’analisi delle DLS e del monitoraggio delle nanoparticelle (Figura5A,B). Il DLS ha identificato particelle con un diametro idrodinamico medio di 67 nm, mentre il sistema NTA misurava una dimensione media di 81 nm. Le lievi differenze di dimensioni erano dovute alle tecniche di dimensionamento delle particelle, tuttavia le dimensioni di entrambe le analisi erano nell’intervallo previsto di 20-u2012100 nm8,24,25. Gli SHB-SAPN sono stati visualizzati da TEM e le immagini hanno mostrato particelle ben formate con la distribuzione delle dimensioni ottenuta dalle due tecniche di dimensionamento delle particelle (Figura 5C). Durante la purificazione della proteina, la colonna è stata lavata con isopropanolo per diminuire la contaminazione da LPS nel prodotto finale SHB-SAPN. Per verificare se il livello di endotossina fosse accettabile per l’immunizzazione, la concentrazione di LPS nei campioni SHB-SAPN purificata con o senza la fase di lavaggio dell’isopropanolo è stata determinata da un test cinetico LAL. I risultati hanno indicato che il lavaggio dell’isopropanolo ha ridotto i livelli di endotossina da >0,25 UE/g a 0,010 UE/g della proteina SHB-SAPN (Tabella 1). Figura 1: Sequenza e struttura della proteina SHB-SAPN. (A) Sequenza di amminoacidi del monomero SHB-SAPN. (B) Modello computerizzato della struttura del nucleo SHB-SAPN completamente assemblato costituito da 60 monomeri proteici. Combinazione di colori per le sequenze di amminoacidi: Grigio – HisTag; Verde : pentamer; Taglio blu scuro – de novo; Azzurro- fascio di sei elica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Diagramma di flusso del per la produzione SHB-SAPN. Schema di colori: Nero – espressione del monomero proteico in E. coli; Grigio scuro – purificazione del monomero; Grigio medio : identificazione del monomero; Grigio chiaro: ripiegamento e caratterizzazione; Bianco: prodotto SHB-SAPN completamente assemblato. Nei gradini etichettati con grigio scuro e medio, la proteina è sotto condizioni di denatura e riduzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Purificazione proteica dei monomeri SHB-SAPN. (A) Cromatografo dalla purificazione FPLC. La linea verde sopra il cromatogramma indica i passaggi di purificazione. La linea blu nel cromatogramma rappresenta la densità ottica delle frazioni a 280 nm di lunghezza d’onda. La linea nera mostra quale percentuale di buffer B (8 M urea, 20 mM Tris, 50 mM di fosfato di sodio monobasico, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazole, pH 8.5) che è stato utilizzato in ogni fase della purificazione. (B) Gel SDS-PAGE delle frazioni raggruppate (L), flusso attraverso (FT), primo lavaggio (W1), lavaggio isopropanolo (W2), terzo lavaggio (W3) e frazioni individuali dai gradini di emidazole (E150) e 500 mM imidazole (E500) Purificazione. I marcatori molecolari nella prima corsia (M) identificano bande comprese tra 10 e 250 kDa. La proteina bersaglio è indicata da una freccia nera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Identificazione della proteina da parte di macchie occidentali. Tutte le corsie sono caricate con 100 ng di proteine. (A) Risultati di una macchia occidentale con HisTag anti-6x. (B) Risultati di una macchia occidentale con un anticorpo monoclonale 167-D-IV HIV-1. Le corsie sono etichettate come: M – marcatore di peso molecolare; 1 – lisato; 2 – Flusso; 3 – primo lavaggio; 4 – lavaggio isopropanolo (secondo lavaggio); 5 – terzo lavaggio; 6 – frazioni di volume raggruppate 56-u201261 (primo picco di elusione), 7 fazioni di volume raggruppate 62-u201267 (tra i due picchi), 8 frazioni di volume raggruppate 68-u201278 (secondo picco di elusione). Proteina di destinazione con la dimensione prevista della banda di 18,07 kDa in quanto la banda monomerica SHB-SAPN è indicata da una freccia nera. Banding extra nelle corsie 7 e 8 sono dimer, trimer e multimers della SHB-SAPN (freccia rossa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: caratterizzazione dell’oggetto SHB-SAPN ripiegato. (A). Distribuzione delle dimensioni delle particelle come determinato da DLS. (B) Dimensione delle particelle determinata dal tracciamento delle nanoparticelle (sistema). (C) Visualizzazione delle particelle SHB-SAPN da TEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. campione Endotossina (UE/mL) Endotossina (UE/g di proteine) SAPN con lavaggio Isopropanol 2.02 0.01 SAPN senza lavaggio Isopropanol >50 >0.25 Controllo negativo Livello di rilevamento inferiore non pertinente Tabella 1: Livelli di endotossina di SHB-SAPN ripiegati. Livelli di endotossina nei campioni SHB-SAPN purificati con o senza lavaggio isopropanolo presentati sia come unità di endotossina/mL che come unità di endotossina/g di proteina SHB-SAPN.

Discussion

La nanotecnologia offre molti vantaggi e soluzioni per lo sviluppo di vaccini di sottounità. I nanovaccine possono presentare ripetutamente gli antigeni come particolato al sistema immunitario ospite aumentando l’immunogenicità26. Mentre ci sono molti tipi diversi di nanovaccino, crediamo che quelli composti da proteine de novo progettati sembrano essere l’approccio più forte per lo sviluppo del vaccino1. Possono essere progettati senza alcuna sequenza omemologia alle proteine ospiti e presentano l’antigene di interesse per la conformazione simile a quella nativa, fornendo allo stesso tempo bassi costi di produzione e alte rese di prodotto. Un primo esempio di questo approccio è la tecnologia SAPN, che abbiamo applicato ai vaccini contro molteplici malattie infettive7. Affrontando le difficoltà nello sviluppo di vaccini HIV-1, abbiamo progettato un nucleo SHB-SAPN unico per presentare efficacemente l’antigene V1V2 in una conformazione trimerica nativa9. Molti obiettivi del vaccino, in particolare per le malattie virali, sono presenti come trimer27. Questo fenomeno indica che la nostra progettazione SAPN ha ampie implicazioni per lo sviluppo di vaccini di sottounità.

In questo metodo viene illustrato come produrre SHB-SAPNs in un sistema di espressione E. coli. Abbiamo espresso elevate rese di proteine (circa 6 mg/100 mL di coltura). La proteina conteneva 10 istidine ed era facilmente purificata utilizzando una cromatografia di affinità metallica immobilizzata con colonna Ni 2. Questa lunghezza della His-Tag è stata trovata come l’ideale per la più alta resa proteica. La proteina purificata conteneva l’intera lunghezza della proteina progettata, come indicato dalla presenza sia del N-terminal EPtad che della ripetizione del terminale C heptad. Abbiamo utilizzato tecniche ampiamente accettate e le abbiamo ottimizzate per l’espressione, la produzione e la caratterizzazione del core SHB-SAPN. La mancanza di produzione della proteina a lunghezza intera durante lo sviluppo di un SAPN contenente un nuovo epitopo proteico potrebbe indicare un problema di espressione del gene nella cellula ospite. In tal caso, il gene e il sistema di espressione devono essere riprogettati e adattati al protocollo descritto. La modifica del tempo di sonicazione o dell’intensità può anche aumentare la concentrazione della proteina a lunghezza intera prevista.

Le particelle ripiegate erano nell’intervallo di dimensioni previsto (da 20 a 100 nm)8,24,25 come determinato dall’analisi di DLS e monitoraggio delle nanoparticelle. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati dall’utilizzo di TEM. Se ci sono problemi in questo passaggio, è normalmente dovuto a un problema con il pH o la forza ionica del buffer di ripiegamento. Quando vengono rilevate particelle di grandi dimensioni sulle tecniche di dimensionamento delle particelle, ciò indica l’aggregazione, che può essere evitata aumentando il pH del buffer di ripiegamento. Se le particelle non vengono rilevate da DLS, verificare la concentrazione della proteina e controllare il pH del buffer. La concentrazione finale delle proteine per la DLS deve essere di almeno 100 g/mL. Se la concentrazione non è il problema, indica l’abbondanza di piccole particelle incompletamente formate, la cui concentrazione può essere ridotta diminuendo il pH. In alternativa, la concentrazione di cloruro di sodio può essere regolata alla gamma ottimale per ridurre al minimo la presenza di particelle con dimensioni indesiderate.

Infine, utilizzando una fase di lavaggio dell’isopropanolo durante la purificazione siamo stati in grado di ridurre la contaminazione LPS dall’host E. coli a 0,01 UE/G di SAPN che è al di sotto del limite della Food and Drug Administration (FDA) di 5 EU/kg di peso corporeo per i prodotti iniettabili 28. Questo livello può essere ulteriormente ridotto utilizzando una colonna di scambio di anion nota anche come colonna Q. Se sono ancora presenti alti livelli di endotossina, controllare tutti i materiali utilizzati per la preparazione del tampone. Ricordatevi di utilizzare solo vetro depyrogenated e plastica senza endotossina in questo metodo.

Questi risultati indicano che abbiamo sviluppato con successo un metodo per produrre il nucleo SHB-SAPN che può essere utilizzato per studi di immunizzazione pre-clinica. Questo metodo con solo lievi modifiche, se presenti, può essere applicato alla purificazione di SHB-SAPNs quando viene aggiunto un antigene di interesse. Utilizzando questo metodo come punto di partenza una delle principali modifiche è nella fase di eluizione. Proteine diverse evengono a diverse concentrazioni di imidazole che devono essere determinate sperimentalmente. L’altra differenza principale potrebbe essere la composizione del buffer di ripiegamento. L’ottimizzazione richiederebbe test di diverse condizioni di pH e punti di forza ionici.

In considerazione del lavoro futuro, sono necessarie solo due lievi modifiche per consentire l’applicazione umana della SHB-SAPN. Il primo è che il vettore di espressione deve essere cambiato in un marcatore selezionabile di resistenza alla kanamicicina a causa dell’allergia all’anguillina nell’uomo29. L’altro grande requisito della produzione di proteine per uso umano è quello di produrre lo SHB-SAPN in supporti animali-free. Uno studio su piccola scala ha già indicato una resa ragionevole di proteine in un supporto vegetale. Il lavoro qui presentato è facilmente scalabile per la produzione di GMP finale come dimostrato con un candidato vaccino antimalarico, FMP01416. Questa produzione FMP014-SAPN su larga scala includeva sia lo scambio di anion che i passaggi di scambio per ridurre ulteriormente i contenuti LPS e Ni2 o più dal prodotto finale. Questo SAPN espresso batterico è già stato aumentato per un imminente studio clinico di fase 1/2a.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da un accordo di cooperazione (W81XWH-11-2-0174) tra la Henry M Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc., e il Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti. L’anticorpo anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV è stato ricevuto dalla dott.ssa Susan s’olla-Pazner attraverso il NIH AIDS Reagent Program.

Materials

10x Tris/Glycine/SDS BioRad 1610732 1 L
2-Mercaptoethanol BioRad 1610710 25 mL
2-propanol Fisher BP26181 4 L
2x Laemmli Sample Buffer BioRad 1610737 30 mL
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers Malvern Panalytical ZEN0040 100 pack
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl BioRad 4561093 10 pack
Ampicillin Fisher BP1760-25 25 g
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] AbCam ab18184 100 mg
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) AIDS Reagent Repository 11681 100 mg
BCIP/NBT Substrate, Solution Southern Biotech 0302-01   100 mL
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems Fisher 09-761-108 A variety of sizes
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm Ted Pella, Inc 01754-F 25 pack
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns GE HealthCare 45-000-325 5 pack
Glycerol Fisher BP229-4 4 L
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) ABCam ab97020 1 mg
Imidazole Fisher O3196-500 500 g
Instant NonFat Dry Milk Quality Biological A614-1003 10 pack
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay Lonza Walkersville 50650U 192 Test Kit
LAL Reagent Grade Multi-well Plates Lonza Walkersville 25-340 1 plate
Magic Media E. coli Expression Medium ThermoFisher K6803 1 L
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters Millipore SLGV033RB 250 pack
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP Southern Biotech 9040-04   1.0 mL
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli ThermoFisher C601003 20 vials
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, BioRad 1610363 1 mL
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL ThermoFisher 66810 8 pack
Sodium Chloride Fisher BP358-212 2.5 kg
Sodium Phosphate Monobasic Fisher BP329-500 500 g
Tris Base Fisher BP152-1 1 kg
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Biosynth International C-1818 100 g
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S Electron Micoscopy Services 541-09-3 25 g
Urea Fisher BP169-500 2.5 kg
Whatman qualitative filter paper Sigma Aldrich WHA10010155 pack of 500
Name Company Catalog Number Comments
 Equipment
ChromLab Software ver 4 BioRad 12009390 Software
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer BioTek EPOCH2 Plate Reader
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor ThermoFisher 096-145075 Rotor
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Gel Imager for Stain free Gels
JEOL TEM JEOL 1400 Transmission Electron Microscope
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BioRad 1658004 To run gels
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer ThermoFisher ND-ONE-W For Protein Concentration
NanoSight NS300 Malvern Panalytical Particle Sizing
NanoSight NTA software NTA Malvern Panalytical Particle Sizing
New Brunswick Innova 44/44R Eppendorf M1282-0000 Incubator/Shaker
NGC Quest 10 Chromatography System BioRad 7880001 FPLC to aid in protein purification
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella, INC 91000S To clean grids
PowerPac Universal Power Supply BioRad 1645070 To run gels
Rocker Shaker Daigger EF5536A For Western
Sonifer 450 Branson also known as 096-145075  Sonicator
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge ThermoFisher 75-006-580 Centrifuge
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs BioRad 1704158 For Western
Trans-Blot Turbo Transfer System BioRad 1704150 For Western
Vortex-Genie 2 Daigger EF3030A Vortex
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Particle Sizing
Zetasizer Software Malvern Panalytical Particle Sizing
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References

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Karch, C. P., Burkhard, P., Matyas, G. R., Beck, Z. Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation. J. Vis. Exp. (150), e60103, doi:10.3791/60103 (2019).
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