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Biochemistry

Entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs) como ferramentas para enriquecimento, isolamento, identificação e caracterização do Proteome SUMO em Câncer de Fígado

Published: November 01, 2019
doi:
10.3791/60098
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1Liver Disease and Liver Metabolism Lab,CIC bioGUNE, Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), 2Proteomics Platforms,CIC bioGUNE, ProteoRED-ISCIII, CIBERehd, 3Advanced Technology Institute in Life Sciences (ITAV)-CNRS-IPBS,UbiCARE

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para enriquecer, isolar, identificar e caracterizar proteínas modificadas pelo SUMO in vivo tanto a partir de células de hepatoma humano quanto de tumores hepáticos obtidos a partir de modelos de camundongos de carcinoma hepatocelular usando entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs).

Abstract

A modificação pós-translacional é um mecanismo chave que regula a homeostase proteica e a função nas células eucarióticas. Entre todas as proteínas semelhantes à ubiquitina no câncer de fígado, a modificação por SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) foi dada a maior atenção. O isolamento de proteínas sumoilado endógenas in vivo é um desafio devido à presença de proteases específicas de SUMO ativos. Os estudos iniciais da SUMOylation in vivo foram baseados na detecção molecular de proteínas sumoilado específicas (por exemplo, por mancha ocidental). No entanto, em muitos casos, os anticorpos, geralmente feitos com proteína recombinante não modificada, não imunoprecipitaram formas sumoilado da proteína de interesse. A cromatografia de níquel tem sido a outra abordagem para estudar a SUMOylation capturando versões com marcade histidina de moléculas de SUMO. Esta abordagem é usada principalmente em células que expressam ou transemensalm de forma transitória com moléculas his-sumo. Para superar essas limitações, entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs) foram desenvolvidas para isolar proteínas sumoilado endógenas. Aqui, descrevemos todas as etapas necessárias para o enriquecimento, isolamento e identificação de substratos sumoilados de células de hepatoma humanos e tecidos hepáticos de um modelo de camundongo de câncer de fígado usando SUBEs. Em primeiro lugar, descrevemos métodos envolvidos na preparação e lyse das células de hepatoma humano e amostras de tecido tumoral hepático. Em seguida, uma explicação completa da preparação de SUBEs e controles é detalhada, juntamente com o protocolo para os ensaios de retirada de proteínas. Finalmente, alguns exemplos são fornecidos sobre as opções disponíveis para a identificação e caracterização do proteoma sumoilado, ou seja, o uso da análise de manchas ocidentais para a detecção de um substrato sumoilado específico de tumores hepáticos ou o uso de proteômica por espectrometria de massa para caracterização de alta produtividade do proteoma sumoilado e interactome em células de hepatoma.

Introduction

O câncer de fígado é o sexto câncer mais comum em todo o mundo e a segunda causa de mortes associadas ao câncer1. O Carcinoma Hepatocelular (HCC) é a forma mais predominante de câncer de fígado primário. Historicamente, os fatores de risco comuns para o desenvolvimento do HCC incluíram infecção crônica por hepatite B ou C e consumo abusivo de álcool. Nas últimas décadas, a síndrome metabólica, diabetes tipo 2 doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) emergiu como fatores de risco para o desenvolvimento de HCC2. O HCC é muito heterogêneo, fenotipicamente e geneticamente, em que uma complexa rede de vias de sinalização é interrompida. Nos últimos anos, embora tenha havido um aumento no nosso conhecimento sobre as vias moleculares implicadas na patogênese do HCC, ainda não há abordagens terapêuticas eficazes para o manejo do HCC. Muitas vias são ativadas em HCC e inibindo um geralmente impulsiona a compensação por outros caminhos3. Esta tem sido uma das principais dificuldades no tratamento do CcH. Assim, uma abordagem mais global pode fornecer uma abordagem terapêutica potencial para o manejo clínico do câncer de fígado, por exemplo, visando modificações pós-translacionais (PTMs), já que múltiplas vias de sinalização podem ser reguladas simultaneamente por PTMs de proteínas.

As modificações pós-translacionais são consideradas como mecanismos-chave que regulam a homeostase proteica e as funções4. As mudanças estruturais e funcionais são introduzidas pelos PTMs, aumentando assim a diversidade proteoma. Os PTMs mais comuns incluem fosforilação, metilação, acetilação, glicosilação, ubiquitinação e conjugação de proteínas semelhantes à ubiquitina (UbLs). Entre todos os UbLs, a modificação de proteínas pela SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) tem atraído a atenção em associação com seu papel crítico em uma variedade de processos celulares, incluindo transcrição, localização celular, reparo de DNA e progressão do ciclo celular 5.Recentemente, a sumoitura mostrou-se alterada no câncer de fígado6,7,8,9,e as mudanças na SUMOylation de proteínas específicas tem sido descrito para desempenhar um papel na progressão de doenças relacionadas ao câncer9.

Em mamíferos, há cinco paralogos SUMO, SUMO-1 a SUMO-5. Até à data, não há evidências experimentais disponíveis sobre a existência de reações endógenas de conjugação SUMO-4 e sumo-5 endógenas no nível de proteína10,11,12. A sumoitura em mamíferos é realizada por uma cascata de thiol-ester enzimática envolvendo três enzimas, a enzima ativadora heterodimérica SUMO (SAE1/SAE2) ou E1, a enzima conjugador SUMO (Ubc9) ou E2 e uma SUMO-E3-ligase específica para cada proteína alvo. A ação de várias famílias de SUMO E3s parece estar em um equilíbrio dinâmico com proteases específicas do SUMO (SUSPs ou SENPs)13 tornando a reação sumoylation altamente reversível. Além disso, apenas uma pequena fração da proteína sumoilada versus proteína total não sumoilado está presente. Assim, isolar proteínas sumoilado endógenas in vivo é bastante desafiador13.

A sumoitura in vivo foi inicialmente estudada pela mancha ocidental usando anticorpos contra a proteína dejuros 14. A imunoprecipitação da proteína foi realizada com anticorpos específicos e, em seguida, a mancha PAGE-ocidental foi realizada com anticorpos anti-SUMO. O principal problema com esta estratégia é que os anticorpos gerados contra uma proteína recombinante não modificada nem sempre são capazes de imunoprecipitar a forma sumoilado de uma proteína. Alternativamente, a cromatografia de níquel após a expressão transitória de versões de histidina marcadas (His6) das moléculas de SUMO e da proteína de interesse tem sido usada para estudar a SUMOylation nas células. Nesta base, será mais conveniente detectar formas modificadas pelo SUMO a partir decélulas expressando de forma etona. Para estudos in vivo, o enriquecimento baseado em tandem-SUMO (SIM) foi demonstrado para a purificação do poliSUMO conjuga16. Outros grupos têm usado abordagens sumo de anticorpos com marcação epitope fornecendo uma ferramenta viável para investigar a sumoylation endógena em células primárias, tecidos e órgãos17,18. E, mais recentemente, nielsen e colegas têm usado enriquecimento baseado em anticorpos para identificar sumo endógeno e site-specific em células e tecidos19.

Para fornecer informações complementares sobre o papel da SUMOylation in vivo, foram desenvolvidas20entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs), também conhecidas como armadilhas sumo. De relevância, as entidades vinculantes à ubiquitina (TUBEs) são consideradas precursoras conceituais das EGs e são ferramentas comercialmente disponíveis para a detecção e isolamento de proteínas poliubiquitiadas21. Subes são proteínas recombinantes que compreendem repetições em conjunto de SIMs, reconhecendo assim moléculas de SUMO em proteínas modificadas com um aumento na afinidade geral para substratos SUMO. As armadilhas sumo foram projetadas apartir da introdução de um SIM2 e SIM3 derivados de uma ligase de ubiquitina E3 em conjunto, em um vetor contendo glutationa S-transferase (GST), uma proteína portadora heterologous20. Embora subes não podem ser usados corretamente para identificar mono-sumoylated alvo proteínas, este método fornece uma ferramenta para facilitar a purificação e identificação de poli-SUMO alvo proteínas in vivo. Aqui, descrevemos a aplicação de SUBEs para isolar proteínas sumoilado tanto em células de hepatoma humano e em biópsias de fígado de rato, uma ferramenta importante para o estudo do câncer de fígado. Um esquema geral do protocolo descrito neste manuscrito é mostrado na Figura 1.

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelos comitês institucionais do CIC bioGUNE para cuidados e manuseio de animais. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal e reduzir o número de animais utilizados. Foram utilizados deficientes de glicina n de glicina(Gnmt) deficientes(Gnmt−/−e seus companheiros de ninhada do tipo selvagem(Gnmt+/+). 1. Preparação celular e linésia NOTA: Aqui, Huh-7 (linha de células hepatoma humana) e THLE2 (linha de células hepáticas humanas) foram usados. Manter as células em placas P100 em mídia de crescimento padrão em 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2-95% umidade. Crescer as células em placas P100 revestimento em uma densidade de 1,2-1,5 × 106 células por prato, contando as células usando uma hemocitometria Neubauer câmara de contagem. Cultura Huh-7 em DMEM complementada com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina-amphotericina B (PSA) e 1% de glutamina. Células thle2 culturaem pratos culturais pré-revestidos com fibronectina de 0,01 mg/mL, 0,01 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) e 0,03 mg/mL tipo de colágeno eu dissolrei em meio de crescimento que consiste no crescimento das células epiteliabras basais (BEGM) complementado com fatores de crescimento (0,4% BPE, 0,1% insulina, hidrocortisona de 0,1%, 0,1% ácido retínico, 0,1% de transferência, 0,1% triiodothyronine, bem como 10% FBS, 1% PSA, 5 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF) e 70 ng/mL phosphoethanolamine. No ponto final do experimento, aspirar a mídia das placas e lavar as células com 5 mL de soro salino estéril 1x fosfato-buffered (PBS). Células de lyse diretamente na placa colocada no gelo usando 500 μL de pino de lysis (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nonidet P-40 (NP40), complementada com cocktail inibidor protease completo edta-livre e 50 μM PR-619 para cada prato P100. Usando um raspador de células, raspe suavemente as células do fundo da placa para o meio de Lysis.NOTA: Verifique se todas as células se separaram da placa inspecionando visualmente a base da placa após o tratamento. Alternativamente, as células de colheita por tripinização por mídia celular aspirante e adicionar 1 mL de 1x (0,05%) trippsin-EDTA para a placa, o suficiente para cobrir as células e colocar a placa na incubadora fixada em 37 °C, 5% CO2,e 95% de umidade para ~ 5 min garantindo que todas as células se separaram da placa. Adicione 2 mL de meio de crescimento pré-aquecido, a fim de parar de trypsinização. Centrífuga a 150 g por 10 min e aspirar o supernatant. Lave com 1x PBS e centrífuga a 150 x g por 10 min. Depois de aspirar o supernatant, adicione 500 μL de douro de lupa (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, complementado com cocktail inibidor de protease completo edta-livre e 50 μM PR-619 para cada prato P100.NOTA: A adição do PR-619 é fundamental. Centrífuga a 15.500 x g e 4°C por 10 min. Transfira o supernatant para outro tubo e descarte a pelota.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, e amostras armazenadas a -80 °C até uma análise mais aprofundada. 2. Preparação de tecidos e lysis Após o sacrifício animal, coletar fígados de rato, lavar com PBS frio, e congelar snap imediatamente em nitrogênio líquido. Guarde as amostras −80 °C até uma análise mais aprofundada. Homogeneize fragmentos de 75 mg de fígados frescos congelados/ou frescos em 1 mL de tampão de lyse gelada (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, complementado com coquetel inibidor protease completo edta-livre e 50 μM PR-619). Executar o homogeneizador em 6500 x rpm, 2 x 60 s cada, com uma pausa de 30 anos (ver Tabela de Materiais). Centrífuga as amostras em uma microfúria em 15, 500 x g e 4 °C por 10 min. Transfira o supernatant para outro tubo e descarte a pelota. Alternativamente, triturar 75 mg de tecidos congelados em nitrogênio líquido. Em seguida, recuperar o tecido em 1 mL de l tampão de l. Centrífuga a amostra em uma microfúria a 15, 500 x g e 4 °C por 10 min. Transfira o supernatant para outro tubo e descarte a pelota.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, e amostras armazenadas a -80 °C até uma análise mais aprofundada. 3. Ligação de GST-SUBEs ou controle de GST aos grânulos da glutathione-Agarose NOTA: A síntese do controle GST-SUBEs ou GST está fora do escopo deste manuscrito e pode ser revisada na literatura publicada anteriormente20. Alternativamente, subes gst e controle estão disponíveis comercialmente (por exemplo, SignalChem). Preparação de grânulos da glutationa Adicione 1 mL de água desionizada a 70 mg de contas de glutatia-agarose lyophilized. Reconstitua as contas durante a noite a 4 °C (ou por pelo menos 30 min à temperatura ambiente). Lave as contas completamente após o inchaço (para remover a lactose e etanol que geralmente estão presentes nas contas de agarose em pó liofilizado). Para fazer isso, primeiro lave com 10 mL de água desionizada ou PBS seguido de centrífuga a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente. Executar isso três vezes. Após 3 lavagens, resuspenda os grânulos em 1 mL de PBS para obter uma pasta de 50% (v/v).NOTA: Este volume é adequado para a análise de 10 amostras. Para cada amostra, adicione 100 μg de GST-SUBEs ou controle GST (ver referência20)a 100 μL do slurry de contas de glutationa e 500 μL de PBS.NOTA: A abundância relativa das proteínas de interesse sumoilado determina a quantidade de GST-SUBEs usados para pull-downs. Para cada novo modelo experimental, analise a condição antes do experimento real, borrando a entrada, encadernado e fluxo através de (FT) material usando anticorpos anti-SUMO2/3 ou contra proteínas de interesse (Fígado Kinase B1 (LKB1). Incubar todos os GST-SUBEs ou controle GST com contas preparadas em 3.2., girando lentamente em rotator ou mini rolo (ver Tabela de Materiais)em 4 °C para pelo menos 2 h (reação de ligação lenta).NOTA: Adicionar 1 mM dithiothreitol (DTT) melhora a ligação do GST às contas de glutationa. Recuperar as contas de agarose por centrífuga em 300 x g por 5 min à temperatura ambiente. No final, resuspendeu as contas na PBS para obter 50% (v/v) chorume.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, e amostras armazenadas a -80 °C até uma análise mais aprofundada. 4. GST Puxar para baixo ensaio Após a etapa 1.5, 2.3 ou 2.5, pegue 1/10 do volume total (por exemplo, 50 μL) e diluir no mesmo volume de tampão de ebulição 3x (250 mM Tris-HCl pH 6.8, 500 mM β-mercaptoethanol, 50% glicerol, 10% SDS, bromophenol azul). Essa fração é considerada input. Adicione 450 μL de lisato clarificado dos passos 1.5, 2.3 ou 2.5 a 100 μL glutathione beads slurry. Incubar o liceu com contas, girando lentamente a 4 °C por pelo menos 2 h.NOTA: Alternativamente, 100-200 μg de proteína total dos passos 1.5, 2.3 ou 2.5 (quantificado com o ensaio de Bradford) em um volume total de 450 μL pode ser usado. Desça as contas em uma microfúgio a 300 x g por 5 min e colete o supernatant para a análise. Transfira 1/10 do volume total (por exemplo, 50 μL) em um tubo separado e diluir em um volume igual de tampão de ebulição 3x. Esta fração é o fluxo de fluxo de fluxo(FT)fração. Lave a amostra restante três vezes com 1 mL gelo-frio PBS, 0,05% Tween 20, spin para baixo em 4 °C e 300 x g para 1 min. Cuidadosamente aspirar garantindo que não resta líquido. As contas correspondem à fração SUBEs BOUND (SB). Elute a amostra com 15 μL de tampão de ebulição 3x e 15 μL do amortecedor da lyse. Isso é chamado de Fração BOUND. 5. Identificação e caracterização de alvos sumo pela análise blot ocidental Realizar a análise de borrões ocidentais usando um anticorpo anti-SUMO2/3 ou qualquer outro anticorpo específico de escolha, como descrito anteriormente22. 6. Identificação e caracterização do Proteome SUMOylated pela espectrometria maciça NOTA: No caso da análise da Mass-Spectrometry (MS), as amostras foram processadas usando o método de Preparação de Amostras Auxiliadas por Filtro (FASP) descrito por Wisniewski et al.23. Dessalte os peptídeos usando microcolunas C18 de ponta de estágio e suspenda-os em 0,1% de ácido fórmico (FA) antes da análise da EM. Carregue as amostras em um sistema LC-MS (ver Tabela de Materiais)e analisá-las em triplicado (replica técnica) (Figura 2b). Continue com o cálculo de identificação e abundância de proteínas usando um software associado. Para análise estatística e geração de mapas de calor, carregue os dados na plataforma Perseus (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). Aplique um teste de t-test baseado em permutação falsa para comparação das abundâncias. Proteínas com q < 0,05 e uma relação SUBEs/GST superior a 2 foram consideradas enriquecidas24.NOTA: Proteínas identificadas com pelo menos dois peptídeos diferentes são consideradas em análise final.

Representative Results

Identificação de um substrato específico da sumoylation em biópsias do tumor do fígado pela análise ocidental do borrão Fígado Kinase B1 (LKB1) SUMOylation foi recentemente mostrado para ser um importante motorista oncogênico no câncer de fígado9,25. Camundongos deficientes em glicina N-metiltransferase (Gnmt),muitas vezes referido como Gnmt−/−, é um modelo que desenvolve espontaneamente carcinoma hepatocelular (HCC), o tipo mais comum de câncer de fígado primário. Subes foram usados para enriquecer e isolar as proteínas sumoilado tanto em Gnmt−/− camundongos com ratos de câncer de fígado e seus littermates tipo selvagem (Gnmt+/+). Na Figura 2a,são incluídas as colorações Ponceau S das três frações diferentes (entrada, FT e BOUND) obtidas no ensaio pull-down dos SUBEs. Uma mancha de Ponceau S é útil para controlar um possível efeito deletério no carregamento de proteínas borradas a serem avaliadas pelas manchas ocidentais. Na Figura 2b uma análise ocidental borrão de LKB1 usando SUBEs para capturar SUMOylated ENDB1 é mostrado. Os níveis de SUMOylation LKB1 são aumentados em tumores hepáticos. No caso da análise ocidental da mancha, as cargas iguais e as proteínas transferidas foram observadas pela coloração de Ponceau da fração da entrada e não foram alteradas significativamente após laves (fluem através da fração). A quantidade de proteína capturada com SUBEs foi significativamente maior, particularmente nos tumores. Alternativamente, colorindo um gel duplicado com azul Coomassie pode fornecer informações semelhantes. Proteínas pegajosas como formas p53 ou sumoilado de algumas proteínas podem se ligar ao controle gst. Para remover o fundo, use contas agarose de baixa densidade, execute um revestimento com BSA ou incorpore lave lavandas adicionais. No entanto, isso pode afetar aplicações como espectrometria de massa e pode resultar em perda de proteínas interagindo de baixa afinidade. Caracterização do SUMO Interactome em células de hepatoma humano pela Análise de Espectrometria de Massa Para investigar a capacidade da sumo-armadilha para interagir com naturalmente sumoylated proteínas, Huh-7 (hepatoma humano) e não-transformado fígado epitelial humano THLE2 linhas celulares foram utilizados. O primeiro passo é a visualização do material total capturado com SUBEs e o uso do GST como controle negativo. Para este fim, podemos usar protocolos convencionais de coloração de proteínas, como mostrado na Figura 3a. Então, realizamos análise de espectrometria de massa. Uma média de 2268 proteínas foram identificadas nas amostras de HUH7 GST (2339, 2297 e 2168 para cada carga, respectivamente), enquanto 2812 proteínas foram identificadas em média na amostra de SUBEs Huh7 (2815, 2817 e 2806). Após a subtração, 742 proteínas foram enriquecidas nas E.U. Por outro lado, foram identificadas em média 2.497 proteínas nas amostras de GST THLE2 (2476, 2520 e 2495, respectivamente) e 2763 nas SUBEs (2823, 2783 e 2684). Destes, 577 foram considerados enriquecidos nas amostras de SUBEs. A análise de réplicas técnicas recupera o mapa de calor mostrado na Figura 3b,que foi calculado usando as configurações padrão disponíveis (distância euclidena, ligação média e pré-processada com k-means). O mapa de calor retrata a distribuição das 100 proteínas mais significativaemente enriquecidas em cada linha celular. Figura 1: Diagrama esquemático do fluxograma de protocolo utilizado para o enriquecimento, isolamento e identificação e caracterização do proteome sumoilado in vivo para o estudo do câncer de fígado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número. Figura 2: Modificação de LKB1 por SUMO-2 em modelos do rato do carcinoma hepatocellular.(a)Manchas Ponceau S das três frações diferentes (entrada, Flow through (FT) e BOUND) obtidas no ensaio de pull-down subes. (b)Análise ocidental de borrão de LKB1 usando entidades vinculantes sumo (SUBEs) para capturar SUMOylated endógeno LKB1; Gapdh é usado como um controle de carga. Clique aqui para ver uma versão maior deste número. Figura 3: Diferenças entre o proteome sumoilado entre o huh-7 tumoral e as linhas celulares humanas thle2 epitelia não transformadas.(a)Mancha sypro de material proteico capturado, com GST (controle negativo) e SUBEs. (c)Mapa de calor que descreve as proteínas diferencialmente enriquecidas em amostras de Huh-7 e THLE2 SUBE. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Discussion

Neste é, fornecemos uma descrição completa e detalhada da metodologia que relata o uso de SUBEs para o enriquecimento, isolamento e identificação e caracterização das proteínas sumoilado em modelos in vivo de câncer de fígado. Tanto em tumores hepáticos de camundongos quanto em células de hepatoma humana, fomos capazes de isolar e identificar corretamente proteínas de interesse sumoilado e realizar uma caracterização de alta taxa de rendimento do proteoma e interactome sumoylate. Mesmo que a síntese de SUBEs esteja fora do escopo deste manuscrito, para obter mais informações, as seguintes referências devem ser analisadas em26. O protocolo descrito é rápido e muito sensível e a etapa crítica do protocolo inclui o uso de inibidores de SENPs (PR-619). Em alternativa, inibidores químicos da isopeptidase, como NEM(N-Etilmaleimide) e IAA (2-Iodoacetamide) no buffer de lyse podem ser usados, no entanto, relatórios anteriores mostraram que, para o protocolo de SUBEs, o uso de PR-619 é vantajoso como o outro inibidores interferem com GST ligando para as contas de glutationa20.

Subes são proteínas recombinantes que compreendem repetições em conjunto de SIMs, reconhecendo assim moléculas de SUMO em proteínas modificadas com um aumento na afinidade geral para substratos SUMO. Devido à sua alta especificidade e sensibilidade, o uso de SUBEs para o isolamento do proteoma sumoilado é vantajoso em relação a outras abordagens na literatura, como a detecção por mancha ocidental de proteínas sumoilado específicas usando anticorpos contra a proteína de interesse ou a cromatografia de níquel usando as diferentes versões com marca histidina de moléculas sumo. No entanto, deve ser levado em consideração que, à medida que o protocolo de SUBEs é realizado condições não desempenadas, a interação entre proteínas sumoilado e outras proteínas interagindo é mantida. Portanto, obtemos informações sobre o interagir sumome em vez de apenas uma lista de proteínas-alvo sumoilado. Assim, mais experimentos são necessários para confirmar se a proteína identificada é um alvo SUMO ou um fator de interação. Outra limitação dos SUBEs é o fato de que o controle de armadilhas GST usadas são capazes de capturar muitas proteínas de fundo relacionadas ao estresse oxidativo. Esta questão é especialmente relevante durante a análise da EM devido à alta sensibilidade da técnica. Para superar essas limitações, foram desenvolvidas26armadilhas sumo biotinylatedas (bioSUBEs). Outra limitação de SUBEs reside no fato de que só somos capazes de capturar proteínas modificadas por SUMO 2 e SUMO 3, enquanto as proteínas modificadas sumo 1 não podem ser isoladas.

Outra preocupação com o uso de SUBEs está relacionada à quantidade de material inicial necessário para o procedimento. O material inicial usado para capturar proteínas sumoilado deve considerar as diferentes condições experimentais exploradas. Embora a sumoitura basana tenha sido relatada em vários contextos celulares, a SUMOylation é um processo que é fortemente induzido após múltiplas condições de estresse/estímulos. Se comparar amostras não tratadas versus tratadas, é preciso ter certeza de que a coluna não está saturada e as diferenças podem ser observadas entre essas condições. No caso dos fenótipos de camundongos que estamos analisando, nenhum tratamento foi usado e os níveis basais de sumoylation são baixos. Por esta razão, grandes quantidades de proteínas foram usadas. O nível de fundo deve ser controlado através da utilização do GST e, se a ligação inespecífica for elevada, a quantidade de material inicial ou o tempo de ligação deverá ser reduzida. A análise da fração FT pode ser indicativa da eficiência de captura, mesmo que essas armadilhas prefiram proteínas poli-sumoilado e um esgotamento total não deve ser esperado, uma redução da sumoylation total é, em geral, bem observada quando a eficiência de captura é Ideal.

Finalmente, outra aplicação da tecnologia SUBEs inclui a combinação da tecnologia SUBEs com ressonância de plasmon de superfície em tempo real (SPR) permitindo as interações em tempo real com proteínas sumoilado de extratos celulares27. Além disso, mais recentemente, as armadilhas biotinylated do SUMO (bioSUBEs) foram desenvolvidas com a vantagem para reduzir o fundo associado aos tag mais grandes, por exemplo, durante a análise da espectrometria de massa26. Além disso, a versão bioSUBE pode ser usada para detectar proteínas sumoilado em células vivas por fluorescência usando streptavidin-rotulado com corantes fluorescentes distintos aproveitando a streptavidin ligação à biotina. Além disso, métodos de detecção e quantificação de proteínas sumoilado podem ser considerados com versões GST e bioSUBEs, como foi feito com as entidades de ligação à ubiquitina tandem (TUBEs)21.

No geral, o uso de SUBEs para o isolamento e caracterização do proteome sumoilado relevante no câncer de fígado é um método rápido e sensível fornecendo vastas informações sobre o papel ainda bastante desconhecido da via sumoilação no câncer de fígado.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por doações do Institut National du Cancer, FRANCE, INCa grant PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (México) concessão 0280365 e o programa REPERE de Occitanie, França (M.S.R.). Além disso, NIH (Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de Salud 2013111114 (para M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en elstatal E Plan de de de Investigación Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER, BIOEF (Fundação Basque para Inovação e Pesquisa em Saúde): EITB Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de Salud Carlos III:PIE14/00031, integrado en el Plan Estatal de Investigación Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER (para M.L.M.-C), Asociación Española contra el Cáncer (T.C.D, M.L.M-C), Prêmio Daniel Alagille EASL (para T.C.D), Fundação Científica de la Asociación Española Contra el Cancer (AECC Scientific Foundation) Rare Tumor Calls 2017 (para M.L.M), Programa da Fundação La Caixa (para M.L.M). Agradecemos à MINECO pelo Severo Ochoa Excellence Accreditation à CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).

Materials

(Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice CIC bioGUNE
0.5% Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
BEBM Lonza/Clonetics Corporation cc-3171
BEGM Bullet Kit Lonza/Clonetics Corporation CC3170
Bromophenol blue Sigma 115-39-9
BSA Sigma A4503
C18 microcolumns Millipore Z720070
Collagen type I Santa Cruz Biotechnology sc-136157
Complete tablets EDTA-free Roche 4693132001
DMEM Life Technologies A14431-01
DTT Sigma 43815
EDTA Sigma E6758
EGF Sigma e9644
FBS Life Technologies 10270
Fibronectin Life Technologies 33010018
Glutamine Life Technologies 25030-024
Glutathione agarose beads Sigma G4510
Glycerol Sigma G5516
GST-Control SignalChem G52-30H
GST-SUBEs SignalChem S291-340G
Huh7 CLS (Cell Lines Service) 300156 https://clsgmbh.de/
IAA (2-Iodoacetamide) Merck L58046844
LKB1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32245
Mini LabRoller Rotator LABNET H5500 https://www.labnetinternational.com
NaCl Merck 106404041000
nanoElute BRUKER https://www.bruker.com/
NEM (N-Ethylmaleimide) Sigma E3876
NP40 Fluka 74385
PBS Life Technologies 14190-094
Peaks software Bioinformatics Solutions Inc. http://www.bioinfor.com/
Phosphoetanolamine Sigma P0503
Ponceau S solution Sigma P7170
PR-619 Merck 662141
Precellys 24 Bertin Technologies P000669-PR240-A
PSA Life Technologies 151-40-122
PSG Life Technologies 10378-016
SDS Sigma L3771
SUMO2/3 antibody Abcam Ab3742
THLE-2 ATCC ATCC CRL-2706 http://www.lgcstandards-atcc.org
timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer BRUKER https://www.bruker.com/
β-mercaptoethanol Sigma 60-24-2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Lopitz-Otsoa, F., Delgado, T. C., Lachiondo-Ortega, S., Azkargorta, M., Elortza, F., Rodríguez, M. S., Martínez-Chantar, M. L. SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer. J. Vis. Exp. (153), e60098, doi:10.3791/60098 (2019).
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