肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES)

すべての実験は、動物のケアと取り扱いのためのCIC bioGUNE機関委員会によって承認されました。すべての努力は、動物の苦しみを最小限に抑え、使用される動物の数を減らすために行われました。3ヶ月齢の男性グリシンN-メチルトランスフェラーゼ(Gnmt)欠損(Gnmt−/−)およびその野生型ゴミ類(Gnmt+/+)が使用された。 1. 細胞調製とリシス 注:本明細書において、Huh-7(ヒト肝腫細胞株)およびTHLE2(ヒト肝細胞株)が使用された。 湿度5%CO2-95%の加湿雰囲気の中で、標準増殖媒体中のP100プレートの細胞を37°Cに保ちます。 ニューバウアー海血測定計計チャンバーを用いて細胞を数えることによって、1皿当たり1.2~1.5×106細胞の密度でめっきするP100プレートで細胞を成長させる。 DMEMにおける培養Huh-7は、10%胎児ウシ血清(FBS)、1%ペニシリン・ストレプトマイシン-アンホテリシンB(PSA)および1%グルタミンを補充した。 培養皿中のTHLE2細胞を0.01mg/mLフィブロネクチン、0.01mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、0.03mg/mLコラーゲン型で添加した気管支上皮細胞増殖基底培地(BEGM)で構成される増殖培地に溶解成長因子(0.4%BPE、0.1%インスリン、0.1%ヒドロコルチゾン、0.1%レチノイン酸、0.1%トランスフェリン、0.1%トリヨードサイロニン、ならびに10S、1%PSA、5ng/mL表皮成長因子(EGF)および70ng/mLホスエタノールアミン。 実験の終点で、プレートから媒体を吸引し、無菌1xリン酸緩衝生理食塩酸(PBS)の5mLで細胞を洗浄する。500 μLのリシスバッファー(50 mM Tris pH 8.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1% 非イデッドP-40(NP40)を使用して氷上に直接置かれたプレート上のLyse細胞は、各P100皿に完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルおよび50μM PR-619を補充した。細胞スクレーパーを使用して、プレートの底部から細胞をLysis培地に軽く削り取ります。メモ:治療後にプレートベースを目視で調べて、すべての細胞がプレートから取り外されていることを確認します。 あるいは、細胞媒体を吸引してトリプシン化して細胞を採取し、1mLの1mLを1x(0.05%)添加するトリプシンEDTAをプレートに、細胞を覆うのに十分な量で、37°、5%CO2、および95%の湿度で設定されたインキュベーターにプレートを入れ、全ての細胞がプレートから剥離していることを確認する。トリプシン化を停止するために、予め温めた成長培地を2mL加えます。150gで10分間遠心分離し、上清を吸引する。1x PBSで洗浄し、遠心分離機を150 x gで10分間洗浄します。上清を吸引した後、500μLのリシスバッファー(50mMトリスpH 8.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1%NP40、P100皿ごとに完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルおよび50μM PR-619を添加する。メモ:PR-619の追加は重要です。 15,500 x gと 4°C で 10 分間遠心分離剤を別のチューブに移し、ペレットを廃棄します。注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルはさらなる分析まで-80°Cで保存されます。 2. 組織の調製とリシス 動物の犠牲に応じて、マウスの肝臓を収集し、冷たいPBSで洗浄し、液体窒素で直ちに凍結をスナップします。さらに分析するまでサンプル−80°Cを保存します。 氷冷リシスバッファーの1 mLでスナップ冷凍/または新鮮な肝臓から75mgの断片を均質化(50 mM Tris pH 8.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1%NP40、完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルおよび50μM PR-619を補充)。ホモジナイザーを 6500 x rpm、それぞれ 2 x 60 s で実行し、30 s の一時停止を行います (「材料表」を参照)。 15、500 x g、4 °Cのマイクロフュージでサンプルを10分間遠心分離し、上清を別のチューブに移し、ペレットを廃棄します。 あるいは、液体窒素中の凍結組織の75mgを三量体化する。次いで、1mLのリシス緩衝液で組織を回収する。 15、500 x g、4 °Cのマイクロフュージでサンプルを10分間遠心分離し、上清を別のチューブに移し、ペレットを廃棄します。注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルはさらなる分析まで-80°Cで保存されます。 3. グルタチオン・アガロースビーズへのGST-SBEまたはGST制御の結合 注:GST-SBEまたはGSTコントロールの合成は、この原稿の範囲外であり、以前に公開された文献20で見直すことができます。あるいは、GSTおよび制御SEは市販されている(例えば、SignalChem)。 グルタチオンビーズの調製 凍結乾燥したグルタチオンアガロースビーズの70mgに脱イオン水を1mL加えます。ビーズを4°Cで一晩再構成する(または室温で少なくとも30分間)。 腫れ上がった後にビーズを十分に洗う(通常凍結乾燥粉末アガロースビーズに存在するラクトースとエタノールを除去する)。これを行うには、まず10mLの脱イオン水またはPBSで洗浄し、続いて室温で5分間300 x gで遠心分離します。このスライスを実行します。 3本のワッシュを行った後、ビーズを1mLのPBSで再サスペンドし、50%(v/v)スラリーを得た。注:このボリュームは、10サンプルの分析に適しています。 各サンプルについて、GST-SBEまたはGST制御の100μg(参照20)をグルタチオンビーズスラリーの100μLと500 μLのPBSに加えます。注:目的の相撲タンパク質の相対的な豊富さは、プルダウンに使用されるGST-SEの量を決定します。新しい実験モデルごとに、抗SUMO2/3抗体または目的のタンパク質(肝臓キナーゼB1(LKB1)に対して、ウェスタンブロッティングインプット、結合、フロースルー(FT)材料をウェスタンブロッティングして、実際の実験前の状態を分析します。 3.2.で調製されたビーズですべてのGST-SBEまたはGST制御をインキュベートし、ローテーターまたはミニローラーでゆっくりと回転(材料表を参照)を4°Cで少なくとも2時間(低速結合反応)します。注:1 mMジチオトレイトール(DTT)を添加すると、グルタチオンビーズへのGST結合が向上します。 室温で5分間300 x gで遠心分離してアガロースビーズを回収します。最後に、ビーズをPBSに再懸濁し、50%(v/v)スラリーを得た。注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルはさらなる分析まで-80°Cで保存されます。 4. GSTプルダウンアッセイ ステップ1.5、2.3または2.5の後、総体積の1/10(例えば50°L)を取り、同じ体積の3倍沸騰緩衝液(250 mM Tris-HCl pH 6.8、500 mM β-メルカプトエタノール、50%グリセロール、10%SDS、ブロモフェノールブルー)を同じ体積で希釈する。この分数は INPUT と見なされます。 ステップ1.5、2.3、または2.5から100 μLグルタチオンビーズスラリーから450μLの透明なリサートを加えます。ビーズでリサートをインキュベートし、少なくとも2時間4°Cでゆっくりと回転させる。注:または、ステップ1.5、2.3または2.5(ブラッドフォードアッセイで定量)から100〜200μgの総タンパク質を450μLの総体積で使用することができます。 300 x gのマイクロフュージでビーズを5分間スピンダウンし、分析のために上清を収集します。全容積の1/10(例えば、50°L)を別々のチューブに移し、3倍沸騰緩衝液の等量で希釈する。この分数は、フロースルー (FT) 分数です。 残りのサンプルを1 mLの氷冷PBS、0.05%Tween 20で3回洗浄し、4°C、300 x gで1分間スピンダウンし、液体が残らないことを注意深く吸引します。ビーズは、SBE BOUND (SB) 分数に対応します。 3倍沸騰緩衝液の15°Lとリシスバッファーの15°Lでサンプルを溶出します。これを BOUND 分数と呼ばれます。 5. ウェスタンブロット分析による相撲目標の同定と特性評価 前に説明したように、抗SUMO2/3抗体または任意の任意の特定の抗体を用いてウェスタンブロット分析を行う。 6. 質量分析法による相撲分プロテオームの同定と特性評価 注:質量分析(MS)分析の場合、ウィスニエフスキら23で説明したフィルター支援試料調製(FASP)法を用いて試料を処理した。 ステージチップC18マイクロカラムを使用してペプチドを脱塩し、MS分析の前に0.1%ギ酸(FA)で再サスペンドします。 サンプルを LC-MS システムにロードし (材料表を参照)、トリプリケート (技術的複製) で分析します (図 2b)。 関連するソフトウェアを使用して、タンパク質の同定と豊富さの計算を続けます。 統計解析とヒートマップの生成については、Perseus プラットフォーム (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/) にデータを読み込みます。豊富な値を比較するために、順列ベースの誤検出率(FDR)補正t検定を適用します。q < 0.05 および SES/GST 比が 2 より大きいタンパク質は、濃縮された 24と見なされました。注:少なくとも2つの異なるペプチドで同定されたタンパク質は、最終分析において考慮される。