使用 PRIMO 微模式系统对蛋白质的光诱导分子吸附，研究细胞对细胞外基质蛋白的反应

1. 图案模板的设计 注：图案模板使用数字绘图软件（材料表）生成。绘制不同的灰色水平将决定激光强度。使用软件设计图案模板允许快速生成具有任何所需几何形状和渐变的图案（图 3）。 使用绘图软件以数字方式绘制所需的图案模板。选择长度为 1824 像素和 1140 像素宽度的图像大小（在本研究中对应于 415 μm 长度和 260 μm 宽度）。将模式模板另存为 8 位 Tiff 文件。注：根据将微图案设备商业化的品牌（材料表），可按要求提供生成模板的分步协议。 2. 等离子清洗 注：最佳结果要求在阵列之前对表面进行等离子清洁，从而去除所有有机物并激活表面。在本例中，环境空气足以进行表面激活。使用等离子清洗器（材料表）的过程压力为1000-1300 mTorr，功率为29.6 W，为1-5分钟。 使用内井尺寸为 20 mm 且玻璃厚度为 0.16-0.19 mm 的玻璃底盘。”要测试多种条件，请使用 6 口玻璃底盘。否则，请使用单井玻璃底盘 （材料表）。注：等离子清洗设备商业化的品牌（材料表）可应要求提供等离子清洗分步协议。 3. 钝化 注：此步骤会产生防污膜，防止蛋白质吸附到玻璃表面。PEG作为抗污剂，对蛋白质吸附29具有高抗性。LIMAP 使用照片设置器通过 UV 光射局部去除 PEG。感兴趣的蛋白质然后会吸附到这些无PEG的表面21，产生微模式。 使用 PLL-PEG 钝化 在无菌条件下，切割 PDMS 模具（参见图 4A、B和材料表），以确保它们适合内部玻璃底部井，并去除使用无菌钳子的内微井填充物。使用钳子将模具粘在玻璃井上。 确保模具紧紧地粘在玻璃上，防止形成气泡，在钝化过程中可能导致泄漏。注：PDMS模具也可以使用已发布的协议18，32内部制造。 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备PLL-PEG溶液（材料表，0.1mg/mL）。在每个微井中加入20μL的PLL-PEG溶液，并在室温下孵育，1小时。 从微井中取出 15 μL 的 PLL-PEG，用 20 μL 的 PBS（材料表）清洗 5 次，而不会使其干燥。注：始终在两次之间留出大约 5 μL 的 PBS。由于微井体积小，特别容易干燥。干燥会导致微模式质量低劣。 将培养皿保持在 PBS 中（每口井 3 mL）4°C 长达 3 天，或继续下一步（步骤 3.1.5）。 从单个微井中取出 18 μL 的 PBS（例如，左上微井，参见图 4D），添加 5 μL 的光发动器（PLPP，材料表），并在剩余的微井中留下 20 μL 的 PBS。在系统校准步骤（步骤 4）期间，此带有 PLPP 的微井将用于创建参考模式（参见图 4D，E）。保护 PLPP 免受光线照射。 具有长效 PEG-SVA 的钝化注：要生成抗粘胶表面，可以使用：1） 与聚-L-Lysine（PLL-PEG，步骤 3.1）或 2） PEG-琥珀-琥珀酸 N-羟基硅酸 （PEG-SVA） 相连的 PEG。选择一个或另一个钝化选项的决定取决于存储选项（请参阅步骤 10）。用PEG-SVA孵育的培养菜肴需要双倍的钝化和光图案。 如步骤 3.1.1 中所述准备模具。 在每个微井中加入 20 μL 的 0.01% Poly-L-Lysine（PLL，材料表），并在室温下孵育 30 分钟，预涂有 PLL。 从微井中取出 15 μL 的 PLL，用 20 μL 的 1 M HEPES 缓冲液（材料表）清洗三次，而不会让水井干涸。注：始终在两次之间留出大约 5 μL 的 HEPES 或 PBS。由于微井体积小，特别容易干燥。干燥会导致微模式质量低劣。 准备 PEG-SVA 解决方案。PEG-SVA溶液（HEPES缓冲液1M中的50mg/mL）应在每次使用前新鲜制备。每微井制备 20 μL PEG-SVA。 HEPES 缓冲器的 pH 必须介于 8-8.5 之间。在用pH纸制备PEG-SVA溶液之前，先测试HEPES pH。使用精密秤在离心管中称重 PEG-SVA。加入HEPES缓冲液和涡旋30s，直到溶解。当溶液透明时，PEG-SVA 被完全溶解。注： SVA 是允许 PEG 与先前涂层的 PLL 结合的酯。一旦 HEPES 缓冲器添加到 PEG-SVA 中，SVA 的半使用寿命为 15 分钟，应立即使用。 将 20 μL 的 PEG-SVA 溶液加入每个微井，并在室温下孵育，从微井中取出 15 μL PEG-SVA，用 20 μL 的 PBS（材料表）清洗 5 次，而不会让井干涸。 准备培养皿进行长期存储（最多 1 个月，请参阅步骤 10.2），或继续执行下一步（步骤 3.2.8）。 从单个微井中取出 18 μL 的 PBS（例如，左上微井，参见图 4D），添加 5 μL PLPP（材料表），并在剩余的微井中留下 20 μL 的 PBS。此微井将用于创建参考模式（参见 Fi gure 4D，E）。确保 PLPP 在微井的整个表面上是同质的。保护 PLPP 免受光线照射。 4. 系统校准 注：在这些步骤中，激光的焦点将调整到特定类型的培养皿（步骤 4.1）。仅在一个微井（步骤 4.2）中生成参考模式，然后使用蛋白质溶液（步骤 4.3）孵育，以确保激光的最佳对焦条件（步骤 4.4），这是获得锐利和定义模式所必需的。 激光校准注：在校准过程中，校准激光图像将投射到荧光高光的玻璃表面（校准良好，标有荧光荧光笔图4C），需要聚焦于显微镜。 使用荧光荧光笔 （材料表） 标记空的内玻璃井.注： 校准井必须具有与生成微图案的培养盘相同的玻璃厚度（0.16-0.19 mm）。如果使用 6 口玻璃底盘，则可以使用空井进行校准，并在无菌条件下使用荧光荧光笔进行标记。 打开显微镜、舞台和计算机。打开 PRIMO 微模式设备、打开微管理器和莱昂纳多软件。莱昂纳多软件通过插件下的微管理器操作。在材料表中查看设备和软件的品牌/目录编号。 在莱昂纳多的初始菜单中，选择”校准”。检查专用的 PRIMO 滤波器立方体在滤波器转塔中是否处于正确位置（光路）;在显微镜和莱昂纳多软件上选择 20X 目标（0.75 DIC S 计划荧光，无相环）。注： 此协议调整为莱昂纳多版本 4.4。该协议可能需要针对其他版本进行调整。 将先前突出显示的校准井（图 4C） 置于目标上方。选择摄像机路径。调整目标焦点，直到PRIMO徽标和标记线的激光投影在焦点内照顾您的细胞。 将默认相机曝光时间保留为 25 ms. 调整激光强度以查看来自 PRIMO徽标投影中的字母I的灰色和其余白色字母。 记录焦平面的 Z 位置（目标对样品的高度），后来称为 Z 位置校准。这将是参考模式生成后获得的最佳焦点的近似值（参见步骤 4.2-4.4）。 参考模式 将培养皿与包含照片发动器的微井（参考模式微井，图 4D）置于目标上方，并在莱昂纳多软件中选择模式。 通过摄像机通过透射光可视化微井边缘，并从右侧菜单中选择 ROI 符号。将 ROI 圆的直径设置为 4000 μm，并将数字 ROI 的边缘与当前微井的边缘对齐。 通过在微井边缘移动舞台，确保数字 ROI 和当前微井之间有准确的重叠。ROI 位置将与舞台运动耦合。 选择锁定莱昂纳多软件将 ROI 锁定在所需位置。关闭传输的指示灯。 选择PRIMO以上载所需的模式模板，该模板将作为设计单元投影到 ROI 上（参见图 5）。模式将显示在下拉列表中，称为”操作”，并显示在软件上的”操作”菜单中。注： 模式模板需要之前设计（请参阅步骤 1），并在在软件中加载模板之前保存为 8 位 Tiff 文件。 参考模式只需要一个小模式;例如，3 行，1 列（参见图 4E和图 5B）。在”复制”菜单中，设置所需的列数和行数（莱昂纳多软件中的行）。单击”刷新”可观察模式设计的数字预览。 在”复制”菜单中设置激光剂量。在此设置和使用PLL-PEG的最佳激光剂量为1390 mJ/mm2。注：激光功率可能介于 5-7.5 mW/mm2 之间。在这种情况下，它是7.5 mW/mm2，这需要大约30s来阵列每个设计单元，使用激光剂量1390mJ/mm2。如果培养皿表面使用 PEG-SVA 钝化（与 PLL-PEG 相比，激光剂量约为两倍），则可能需要更高的激光剂量。这需要事先测试。 导航到微井的外围区域（例如，顶部部分），远离微井的阵列生成（中心区域）的主要感兴趣区域（参见图 4E），然后选择”锁定”。等待，直到显示图案。 将焦点调整到校准的 Z 位置（请参阅步骤 4.1.6）。注： 如果其他用户在光图案轮之间使用相同的显微镜，建议执行额外的系统校准步骤。 选择”播放”符号以开始图案化。确保软件中的激光处于打开位置。等待，直到模式化过程完成。图案持续时间将显示在”估计时间”面板中。在莱昂纳多软件版本4.4模式完成后，所有操作显示为蓝色在可视化菜单。 参考模式的蛋白质孵育 在无菌条件下，用20μL的PBS清洗参考型微井三次，以去除PLPP。 在PBS中加入20μL荧光标记ECM蛋白（10μg/mL拉米宁、纤维蛋白或纤维蛋白原，参见材料表和步骤6）到参考模式微井。在室温下孵育10-20分钟（取决于蛋白质），防止光线照射（用铝箔包装盘子）。 孵育后，去除18μL的蛋白质溶液，用20μL的PBS洗涤三次;将未用于创建参考模式的微井保存在 PBS 的 20 μL 中（参见图 4D，E）。 可视化和设置最佳激光对焦 使用荧光显微镜、20X 物位和合适的软件（在材料表中检查本研究中使用的软件）来可视化参考模式。引用模式应在生成参考模式的外围区域（例如，上井区域）中可见（参见图 4E）。 通过相机路径调整图案边缘的焦点。根据参考模式的最佳焦点记录 Z 位置。此调整后的 Z 位置将是用于后续图案的最佳激光焦点。 5. 软件设置和照片图案 注：完成系统校准后（步骤 4），用户将上传所需的图案模板（模板配置，图 5）进行照片图案设计，并可选择为每个蛋白质生成一个或多个模式微井。微图案过程涉及光图案和蛋白质孵育步骤（见图2）。 在无菌条件下，从所有微井中取出18μL的PBS，并在每个微井中加入5μL的PLPP。确保 PLPP 在微井的整个表面上是同质的。 将文化盘与参考模式微井（图4D，E）置于目标上方，并在莱昂纳多软件中选择模式。 通过摄像机路径使用透射光可视化微井，并选择 ROI 符号。将 ROI 的直径设置为 4，000 μm，并将数字 ROI 的边缘重叠到当前微井的边缘。选择锁定。注：ROI 的形状和直径取决于所使用的 PDMS 模具的设计和尺寸。例如，如果使用 5，000 x 5，000 μm PDMS 方形模具，请使用 5，000 x 5，000 μm 平方 ROI。 对盘的每个微井重复重叠步骤（步骤 5.3）。完成后，关闭传输的指示灯。 导航到参考模式微井的中心，远离参考模式区域，然后选择PRIMO以上载所需的模式模板，该模板将作为设计单元投影到 ROI 上（参见图 5）。模式将显示在下拉列表中，称为”操作”，并显示在软件上的”操作”菜单中。注意：模式模板需要在实验之前设计，并在软件中加载模板之前保存为 8 位 Tiff 文件。 为了在整个微井中创建一个模式，需要复制设计单元。设计单元覆盖微井面积约 0.1 mm2。在”复制”菜单中，设置所需的列数和行数（软件中的行）（参见图 5）。 要生成连续模式，请调整列和线之间的间距;在本研究中，连续条纹的模式是使用-20至-35 μm间距（负间距）的列。此负间距在设计单元之间创建重叠（图5B，C）。 在”复制”菜单中设置激光剂量。在此设置和使用PLL-PEG的最佳激光剂量为1390 mJ/mm2。图案持续时间将显示在”估计时间”面板中。注：在这种情况下，激光功率为7.5 mW/mm2，使用1390 mJ/mm2的剂量，对每个设计单元进行大约30s的阵列。例如，在 4 列和 4 行（约 1.6 mm2）中复制的设计单元 （0.1 mm2） 需要 8 分钟才能进行图案化。如果培养皿表面使用 PEG-SVA 钝化（与 PLL-PEG 相比，激光剂量约为两倍），则可能需要更高的激光剂量。 选择”锁定”并等待，直到模式虚拟显示。 要更新模式的参数，请单击相关的操作，然后解锁并更新参数。完成模式更新后，再次选择”锁定”。 在同一微井（顺序微模式轮）中，多个蛋白质的图案需要精确对齐模式。要实现这种对齐，请同时上传所有所需图案模板集（第一个和第二个照片图案轮模式）。 设置模式模板的复制和剂量参数。设置参数后，模式将在”操作”列表中显示为”操作”。 将此模板配置另存为软件中的文件（参见图 5D）。 在”操作”列表中，仅选择在第一个模式轮圈期间要图案化的特定操作，然后取消选择在第二个模式轮值期间将模式化的操作（参见图 5D）。 导航到步骤 4.2 中生成参考模式的区域（例如，参考模式微井的顶部区域，参见图 4E）。将焦点调整到最佳 Z 位置（在步骤 4.4 中获得）。注： 强烈建议在正在使用的显微镜上选择完美的对焦系统（如果可用），以确保在整个照片图案过程中保持最佳的图案化 Z 位置。 选择”播放”符号以开始图案化。图案持续时间将显示在”估计时间”面板中。在莱昂纳多软件版 4.4 模式设置完成时，所有操作在可视化菜单中显示为蓝色。 6. 蛋白质孵化 注：微井用ECM蛋白孵育（最好是荧光标记）。这些将仅绑定到 PEG 通过步骤 5 中描述的光图案过程被刻下的区域。每口井都含有一个带有4个微井的PDMS模具，允许同时测试4种不同的条件，例如，在每个微井中孵育不同的蛋白质（见图4D）。 使用荧光标记的蛋白质（例如，拉米宁、纤维蛋白或纤维蛋白原与红色或绿色荧光团结合），以可视化微模式（参见步骤 6.7 和 9.4）。或者，吸附未标记的蛋白质可以在后期使用免疫荧光进行可视化。注： ECM蛋白（例如，纤维素）可以使用现有协议33和市售荧光标签套件（即Alexa 488标签试剂盒）进行标记，或购买容易标记（例如，合苯纤维蛋白原-488或拉米宁-红色荧光红胺，见材料表）。 在无菌条件下，制备所需的ECM蛋白浓度（10μg/mL层宁、纤维蛋白或纤维蛋白原在PBS中，见材料表和步骤4.3）。注：荧光标记的ECM蛋白对光敏感，应防止光线（用铝箔包装盘），并应始终保存在冰上。 在无菌条件下，用20μL的PBS清洗微井三次，以去除PLPP。 从所有微井中取出 18 μL 的 PBS，并在每个微井中加入 20 μL 的 ECM 蛋白溶液。在室温下孵育20-30分钟，防止光线照射。注：最佳涂层孵育时间可能因蛋白质的类型和浓度而异。 孵育后，去除15μL的ECM蛋白溶液，用20μL的PBS清洗微井三次。注：始终在两次之间留出大约 5 μL 的 PBS。 如果只使用一种蛋白质（一轮微模式）进行图案化，则继续存储培养皿（步骤 10）或细胞电镀（步骤 11，参见图 2）。如果在同一微井中用不同蛋白质执行第二轮微模式，则继续存储培养皿（步骤 10）或阻止未特定的结合位点（步骤 7，参见图 2）。 可选的质量控制步骤：在电镀电池之前，使用荧光显微镜可视化和图像打印图案。选择适当的荧光通道并相应地调整曝光时间。注：要比较实验模式的荧光强度，对相同蛋白质使用相同的暴露时间至关重要。 7. 阻断非特异性结合位点（仅适用于多种蛋白质模式） 注：在同一微井中具有多个蛋白质的微阵列涉及顺序模式化步骤（参见图2）。在微井中加入阻滞剂（PLL-PEG 或 BSA），以防止交叉结合，当第二个孵育蛋白（步骤 9）与第一个孵育蛋白结合（步骤 6）时发生交叉结合，从而避免模式内蛋白质的混合物。 在无菌条件下，加入20μL的PLL-PEG（PBS中0.1毫克/升/升）或BSA（PBS中的1%BSA），作为阻止步骤，以防止交叉结合。注：阻塞效率可能因所使用的蛋白质的性质及其相关性而异。建议事先将 PLL-PEG 和 BSA 测试为阻塞剂（图 10D-I）。 在室温下孵育阻隔剂1小时，防止光线照射。去除15μL的阻滞剂，用20μL的PBS清洗所有微井三次。始终在两次之间留出大约 5 μL 的 PBS。 从所有微井中取出 18 μL 的 PBS，并在每个微井中加入 5 μL PLPP，确保 PLPP 在微井的整个表面上是均匀的。 8. 第二轮光图案（仅适用于多种蛋白质模式） 注：在第一轮光图案和蛋白质孵育后，生成微模式。在第二轮光图中，第二种蛋白质的图案将在同一微井中生成（参见图2C和图5D）。在软件中，选择正确的模式模板（操作），将在此轮中进行模式化（参见图 5D）。 导航到第一个微井 （图 4D）。确保数字 ROI 和微井之间适当重叠。 加载以前保存的模板配置（步骤 5.12），并选择在第二个照片图案轮中要设置图案的操作（从第一轮中取消选择操作，参见图 5D）。 选择”播放”符号以开始图案化。确保软件中的激光处于打开位置。 9. 第二轮蛋白质孵育（仅适用于多种蛋白质模式） 注：在协议的这一部分，荧光标记的蛋白质/s将在第二轮光图案后在培养皿上孵育。 在无菌条件下，用20μL的PBS清洗微井三次，以去除PLPP。去除18μL的PBS，并在每个微井中加入20μL的ECM蛋白溶液。在室温下孵育20-30分钟，防止光线照射。注：最佳涂层孵育时间可能因蛋白质的类型和浓度而异。 孵育后，去除15μL的ECM蛋白溶液，用20μL的PBS清洗微井三次。始终在两次之间留出大约 5 μL 的 PBS。 继续存储培养皿（步骤 10）或细胞电镀（步骤 11，参见图 2）。 可选的质量控制步骤：使用荧光显微镜，在电镀电池之前可视化和图像打印图案。选择适当的荧光通道并调整曝光时间。注：要比较实验模式的荧光强度，对相同蛋白质使用相同的暴露时间至关重要。 10. 微模式的储存 注：具有吸附蛋白的微模式可以在协议的不同步骤中存储（参见图2）。如果使用多种蛋白质进行微模式，则在第一轮微模式处理后或完成两轮连续的微模式后，可以存储微模式（参见图 2B）。 使用 PLL-PEG 钝化时，将微模式储存在 PBS 中（每口井 3 mL），在 4°C 下存储长达 3 天。 如果培养皿被PEG-SVA钝化，微模式可以储存长达1个月。为此，使用双蒸馏脱离子水密集冲洗微模式，并使用无菌气枪干燥，尽管也可以使用正常空气。干燥后，微模式可在4°C下储存长达1个月（PRIMO系统支持团队，个人沟通）。 11. 电镀电池 注：在接下来的步骤中，细胞将被镀在制备的微图案培养皿上。在这些研究中，使用神经元细胞系（CAD细胞）31。然而，该协议可以调整，以研究其他细胞类型的兴趣（根据需要调整细胞电镀协议）。 使用分化培养基（DMEM补充1%谷氨酰胺，不含血清，1%笔/链球菌，见材料表），将CAD细胞区分48小时。 板 1 mL 的介质，内玻璃孔中装有细胞，覆盖所有微孔，并将培养皿放入 37°C、5% CO2培养箱中。