Summary

סלמונלה כרונית זיהום דלקת מעיים פיברוזיס

Published: September 22, 2019
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר של סלמונלה פיברוזיס המעי מונחה הדומה הסימנים העיקריים מפתח פתולוגי של מחלת קרוהן כולל דלקת קיר ופיברוזיס. שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך גורמים מארחים לשנות את התוצאות הפיברוטיות באמצעות עכברים מוטציה המתוחזקות על C57Bl/6 רקע גנטי.

Abstract

רקמות פיברוזיס המאופיינת הצטברות פתולוגית של מטריקס מסחטות כגון קולגן היא תוצאה של דלקת מתמשכת ותיקון מוסדר. ב מחלת המעי הגס (IBD), פיברוזיס מוביל תצורות סטריקצ’ור חוזרים שבהם אין טיפול יעיל מלבד כריתת כירורגית. בשל התחלתה המאוחרת, התהליכים כי הכונן פיברוזיס הוא פחות לומד ובעיקר לא ידוע. לכן, סיבוכים פיברופטיים מייצגים אתגר מרכזי ב-IBD. בפרוטוקול זה, חזקה במודל vivo של סיסטיק מעיים מתוארת כאשר סטרפטומיצין טרום טיפול של C57Bl/6 עכברים ואחריו gavage אוראלי עם כיתה החיסון סלמונלה typhimurium ΔAroA מוטציה מוביל מושבת פתוגן מתמשך ו פיברוזיס של המעי. מתודולוגיות להכנת S. Typhimurium עבור החיסון, בדיקת הפתוגן העומסים המעי הטחול, והערכת התצהיר קולגן ברקמות המעי מוסברים. מודל זה מחלה ניסויית שימושי עבור בדיקת גורמים מארחים כי גם לשפר או להחריף את תקליטור כמו פיברוזיס מעיים.

Introduction

קוליטיס כיבית (UC) ו קרוהן מחלת (CD) הן שתי הצורות הגדולות של ibd והם מאופיינים כמו כרונית הפרעות דלקתיות במערכת העיכול 1,2. הפרעות אלה יש השפעה גדולה על איכות החיים של החולים. תסמינים של IBD כוללים כאבי בטן, שלשול, בחילות, ירידה במשקל, חום, ועייפות3. מחקרים שנעשו לאחרונה זיהו גורמים גנטיים וסביבתיים שתורמים הפתוגנזה המחלה; הוא חשב כי גורמי סיכון כאלה לתרום הפרעה של מכשול האפיתל וכתוצאה מכך טרנסלוקציה או דגימות יתר של אנטיגנים לומיאל4. כתוצאה מכך, זה יוזם תגובה דלקתית מחריגה על פלורה הקומנדונית מתווכת על ידי תאים חיסוניים מעיים4. תכונות של סיבוכים הקשורים ibd יכול להאריך לאתרים מעבר למערכת העיכול המשפיעים על איברים שונים כולל המפרקים, העור, והכבד1,2. סימנים מכילים של UC כוללים דלקת חמורה לפזר בדרך כלל מקומי במעי הגס1. פתולוגיה של מחלות משפיעה על רירית ורירית המעיים של המעי וכתוצאה מכך כיבית שטחיים1. לעומת זאת, תקליטור יכול להשפיע על כל חלק של מערכת העיכול למרות הראיות של מחלה נמצא בדרך כלל המעי הגס ו-הדימעי2. יתר על כן, דלקת ב-CD הוא טרנסקיר, המשפיעה על כל השכבות של קיר המעי2.

כמה גנים הרגישות IBD אשר זוהו מצביעים כי דיסרגולציה של המכשול האפיתל או חסינות הם תורמים קריטיים התקדמות המחלה5. מוטציות בתחום הנוקלאוטיד 2 (NOD2) מבוטא על ידי מונוציטים נמצאה קשורה עם רגישות מוגברת לתקליטור; זה מדגיש את הקשר בין זיהוי המערכת החיסונית שונה של רכיבים חיידקיים ואת המחלה6. לאחרונה הגנום-wide לימודי התאגדות (GWAS) חשפו מסלולים נוספים העלולים להיות מעורבים בפתוגנזה של IBD כולל וריאציות גנטיות ב: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R מסלולים תלויים מקושר לחסינות אדפטיבית, MUC1, MUC19 וPTGER4 בתחזוקת מחסומי מעיים, ובATG16L-מתווך מותאם אוטומטית7,8,9. בעוד מחקרים אלה מבוססי האוכלוסייה הגנטיקה הגדילו את ההבנה שלנו של ibd, אללים הרגישות לבדה לא מספיקים ליזום ולקיים מחלה כרונית3. גורמים אחרים שאינם גנטיים כולל שינויים בהרכב microbiome בבטן וירידה בגיוון הקשורים לדלקת במעיים. עם זאת, לא ברור אם הבטן לפני או היא תוצאה של התגובות החיסונית מוסדר3. למרות האטיולוגיה של IBD נשאר ברור, ההבנה שלנו של הפתוגנזה של המחלה שופרה על ידי מודלים העכבר הניסיוני של דלקת המעיים10,11. מודלים אלה באופן אינדיבידואלי אינם מייצגים באופן מלא את המורכבות של המחלה האנושית, אבל הם יקרי ערך להסבר מסלולים pathפסלוגיים כי יכול להיות רלוונטי IBD ולאימות של אסטרטגיות טיפוליות בלתי סופי10, . בסדר, 11 מודלים אלה עכבר בדרך כלל להסתמך על ייזום של דלקת על ידי אינדוקציה כימית או זיהום, העברת תאים חיסוניים, או מניפולציה גנטית. יתר על כן, אסטרטגיות אלה לעיתים קרובות כרוך רטבאליות בשלמות אפיתל או אפנון של חסינות מולדים או אדפטיבית.

סלמונלה בידור serovars הם פתוגנים מעיים שיכולים להדביק בני אדם ועכברים. לאחר בליעה, סלמונלה יכול ליישב את הבטן על ידי פלישה ישירה של epithelia, M תאים, או אנטיגן הצגת תאים12. עכברים נגועים דרך הפה עם S. Typhimurium מביא את הקולוניזציה בעיקר של אתרים מערכתית כגון הטחול ובלוטות הלימפה מצע עם שפע נמוך יחסית במערכת העיכול12. עם זאת, טיפול מקדים של עכברים עם סטרפטומיצין משפר את היעילות של סלמונלה מושבת המעיים על ידי הפחיתה את ההשפעות ההגנה המארחת של מיקרוביוטה נורמלי13. התכונות הפתולוגיים של מודל זה כוללות הפרעה או כיבית של מכשול האפיתל, גיוס גרנולוציט, ובצקת חמורה13. לחילופין, זיהום עם כיתות החיסון S. מוטציה ΔAroA typhimurium מוביל לקולוניזציה כרונית של מעי והמעי הגס הנמשכת עד היום 40 לאחר זיהום14. . הס’ המתח ΔAroA typhimurium יש פגם בביוסינתזה של חומצות אמינו ארומטיות; זה הופך את זן מוטציה avirulent והוא יכול להיות מנוצל כחיסון יעיל מאוד15. זיהום אוראלי בעכברים מוביל Th1-ו-Th17-cytokine תגובה דלקתית הקשורים, שיפוץ רקמות נרחב, ואת התצהיר קולגן. פתולוגיה רקמות קשורה לרמות גבוהות של גורם פרו-פיברוטי כגון TGF-β1, CTGF, ו IGF14. הצלקות הטראנקינטיות שדווחו במודל זה מזכירים את תצורות של סטריקצ’ור שנצפו לעתים קרובות ב-IBD. האינדוקציה של פיברוזיס על ידי סלמונלה דורש התקפה אלימה על ידי האיים הפתוגניות של סלמונלה (SPI)-1 ו-2 12. . חשוב מכך, זה ה מודל הדלקת העור ΔAroA מהווה מערכת שימושית לחקר תגובות פיברוטיות בעכברים מוטנטים המתוחזקים ברקע C57/Bl6. הזן C57/Bl6 הוא רגיש מאוד ל -S. Typhiumurim SL1344 זיהום בשל אובדן של פונקציה מוטציה ב הגן קידוד ההתנגדות הטבעית הקשורים מקרופאג חלבון (nramp)-116,17. מצאנו כי IL-17A ו-רוα תלוי בתאי הלימפה מולדים הם תורמים חשובים בפתוגנזה במודל זה18.

סיבוך משמעותי של תקליטור הוא מוסדר ומוגזם התצהיר של מטריקס מסחטות (ecm) כולל קולגן2,19. למרות מערכת העיכול יש קיבולת גבוהה יחסית להתחדשות, הצטלקות פיברוטיק יכול לנבוע בשל תגובות ריפוי הפצע לא פתורות המשויכים דלקת כרונית וחמורה20,21. בתקליטור, התוצאה היא השפעות מדלשליליות על ארכיטקטורת הרקמה המובילה לפגיעה משמעותית באיברים21,22. הטבע הטרנסציורי של הדלקת שנצפתה בתקליטור בסופו של דבר לפני העיבוי של קיר המעי הקשורים היצרות סימפטומטי או היווצרות סטריקצ’ור21. כשליש מהחולים בתקליטור דורשים כריתת מעיים של סיבוך זה22. אין טיפולים אנטי פיברופטיים יעילים ibd בהתחשב בכך שהשימוש בוקחת כגון azath, או אנטי-tnfα ביולוגי אין השפעה או רק בצניעות מופחתת הדרישה של התערבויות כירורגי19,23 . בעוד סיסטיק הוא חשב להיות תוצאה של דלקת כרונית, תאים של מוצא mesenchymal כגון פיברותקיעות ו קרום הלב הם נחשבים מקורות סלולריים העיקרי של ecm בפיברוטיק צלקות21,24. כרונית ס’. הזיהום ΔAroA typhimurium הוא מודל עכבר חזק של סיסטיק מעיים שיכול להציע תובנות לתוך הפתוגנזה של תכונות כמו תקליטור.

Protocol

כל פרוטוקולי החיות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קולומביה הבריטית. 1. הכנת סלמונלה typhimurium ΔAroA תרבויות לgavage אוראלי של עכברים . מתוך מלאי של גליצרול קפוא Typhimurium ΔAroA, להכין צלחת פס באמצעות LB אגר המכיל 100 μg/mL סטרפטומיצין עם לולאה סטרילית. המלון…

Representative Results

טיפול סטרפטומיצין ואחריו זיהום אוראלי עם S. Typhimurium ΔAroA מוביל לדלקת מעיים חזקה פיברוזיס במיוחד מעי (איור 1). בעול הפתוגן אופייני של 108 עד 109 cfu ל 1 גרם של מעי ו 104 cfu per 1 g של הטחול ניתן לשחזר בעלי חיים נגועים (איור 2). הערכה של פיברוזיס ב picrosirius ק…

Discussion

ההבנה שלנו של הפתוגנזה של IBD היה משופר מאוד על ידי מודלים העכבר של דלקת במעיים. למרות מודלים בודדים כגון לא לכידה של כל התכונות של מחלת האדם מורכבים ורב עצרת, הם היו שימושיים בזיהוי תכונות מפתח של התקדמות המחלה. הטיות פיברוטית הקשורים IBD נשאר צורך קליני מרכזי מבחינה קלינית כאשר הטיפולים הנו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לאינגריד ברטטה. על שירותי היסטולוגיה

Materials

2 ml round bottom safe lock tubes Eppendorf 22363344
Stainless steel beads Qiagen 69989
PBS Gibco 10010031
Large-Orifice Pipet Tips Fisher 2707134
2 mL megablock plates Sarstedt 82.1972.002
Gavage needles FST 18061-22
Streptomycin sulfate Sigma S9137
Mixer mill Retsch MM

References

  1. Danese, S., Fiocchi, C. Ulcerative colitis. New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).
  2. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  3. Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome. Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).
  4. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  5. Cho, J. H. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).
  6. Ogura, Y., et al. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn’s disease. Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).
  7. Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
  8. Rivas, M. A., et al. Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease. Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).
  9. Rioux, J. D., et al. Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis. Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).
  10. Uhlig, H. H., Powrie, F. Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease. European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).
  11. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
  12. Grassl, G. A., Finlay, B. B. Pathogenesis of enteric Salmonella infections. Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).
  13. Barthel, M., et al. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
  14. Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
  15. Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
  16. Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance. Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).
  17. Valdez, Y., et al. Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice. Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).
  18. Lo, B. C., et al. The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn’s disease. Science Immunology. 1 (3), eaaf8864 (2016).
  19. Burke, J. P., et al. Fibrogenesis in Crohn’s disease. American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).
  20. Hogan, B. L., et al. Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function. Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).
  21. Fiocchi, C., Lund, P. K. Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).
  22. Rieder, F., Fiocchi, C. Intestinal fibrosis in IBD—a dynamic, multifactorial process. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).
  23. Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. Surgery for adult Crohn’s disease: what is the actual risk?. Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).
  24. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).
  25. Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
  26. Lo, B. C., et al. IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection. Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).
  27. Fichtner-Feigl, S., et al. Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis. Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).
  28. Fichtner-Feigl, S., et al. IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis. Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).
  29. Johnson, L. A., et al. Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a "Top-Down" approach to intestinal fibrosis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).
  30. Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn’s disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
  31. Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. Persistent infection with Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis. Nature Communications. 4, 1957 (2013).
  32. Imai, J., et al. Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. , (2019).

Play Video

Cite This Article
Lo, B. C., Shin, S. B., Messing, M., McNagny, K. M. Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis. J. Vis. Exp. (151), e60068, doi:10.3791/60068 (2019).

View Video