Método de electroporación para la entrega in Vivo de ADN plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra

Zebrafish son excelentes modelos animales para examinar la regeneración cerebral después de una lesión en la herida de puñalada. En comparación con los mamíferos, en la escala evolutiva, las especies menos evolucionadas como el pez cebra generalmente muestran tasas más altas de neurogénesis constitutiva y áreas más amplias de residencia de células madre neurales adultas, lo que conduce a la generación constante de nuevas neuronas a lo largo de la mayoría de las áreas cerebrales en la vida adulta. Esta característica parece correlacionarse con una capacidad regenerativa significativamente mayor del pez cebra en comparación con los mamíferos¹, ya que los peces cebra tienen un potencial notable para generar eficientemente nuevas neuronas en la mayoría de los modelos de lesiones cerebrales estudiados^{2, 3,4,5,6,7,8}. Aquí se estudia el telencéfalo de pez cebra, ya que es un área cerebral con neurogénesis prominente en la edad adulta. Estas zonas de neurogénesis adulta son homoólogas a zonas neurogénicas en el cerebro adulto de^{mamíferos9,10,11}.

Abundantes áreas neurogénicas en el telencéfalo de pez cebra están presentes debido a la existencia de glia radial como células o células de ependymoglia. Las células ependymoglial actúan como células madre neurales adultas residentes y son responsables de la generación de nuevas neuronas en el cerebro intacto y regenerador^3,5. Los experimentos de rastreo de linaje han demostrado que la ependymoglia ventricular reacciona a la lesión, luego proliferan y generan nuevos neuroblastos que migran al sitio de la lesión^5. Debido a la naturaleza evertida del telencéfalo de pez cebra, las células epentimoglial eslacionan la superficie ventricular y construyen la pared ventricular ventral. La pared ventricular dorsal está formada por una capa de células ependitas dorsales(Figura 1A). Es importante destacar que la epentioglia del pez cebra encarna las características tanto de la glia radial de mamíferos como de las células epentimales. Los procesos radiales largos son una característica típica de las células glia radiales, mientras que las extensiones celulares y las uniones estrechas (así como sus posiciones ventriculares) son características típicas de las células epentimales^12,13,14. Por lo tanto, estas células se conocen como células epenymoglial.

Para seguir el comportamiento in vivo de células ependymoglial individuales durante la regeneración, deben etiquetarse de forma fiable. Se han descrito previamente varios métodos de etiquetado de células in vivo para microscopía fluorescente, como reporteros endógenos o colorantes lipofílicos^15. Estos métodos, a diferencia de la electroporación, pueden requerir períodos de tiempo más largos y a menudo no ofrecen la posibilidad de etiquetado de una sola célula o rastreo permanente a largo plazo. La electroporación, sin embargo (además del etiquetado de una sola célula), ofrece la posibilidad de introducir nuevo ADN en la célula huésped. Además, en comparación con otros métodos de transferencia de ADN a las células, se ha demostrado que la electroporación es uno de los métodos más eficientes^16,17,18,19.

Aquí se presenta un protocolo de electroporación que se ha refinado con el fin de etiquetar células ependymoglial únicas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo permite el etiquetado de células epentimogliales individuales con el fin de seguirlas a largo plazo²⁰ o manipular vías específicas de manera autónoma celular^21,22.