שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון
Summary
מוצג כאן הוא שיטת אלקטרופורציה עבור משלוח ה-DNA של הפלזמה ותיוג תא ependymoglial במבוגר בלדג טלנצאלון. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה ויעילה כדי להמחיש ולעקוב אחר תאים ependymoglial בודדים ופותחת אפשרויות חדשות להחיל אלקטרופורציה על מגוון רחב של מניפולציות גנטיות.
Abstract
אלקטרופורציה היא שיטת המשך החצייה שבה שדה חשמלי מוחל על תאים כדי ליצור נקבוביות זמניות בקרום התא ולהגדיל את החדירות שלה, ובכך לאפשר למולקולות שונות להיות מוצגים לתא. במאמר זה, אלקטרופורציה משמש כדי להחדיר פלמידים כדי ependymoglial תאים, אשר קו האזור החדרית של המבוגר ביותר הדגים telencephalon. חלק של תאים אלה מראה מאפייני תא גזע ומייצר נוירונים חדשים במוח דג זברה; לכן, לימוד התנהגותם חיוני כדי לקבוע את תפקידם בנוירוגנזה והתחדשות. הקדמה של פלסטלינה באמצעות אלקטרופורציה מאפשרת תיוג לטווח ארוך ומעקב אחר תא ependymoglial יחיד. יתר על כן, פלמידים כגון היצורים recombinase או Cas9 יכולים להיות מועברים לתאים בודדים ependymoglial, אשר מאפשר שילוב גנים או לערוך גנים ומספק הזדמנות ייחודית להעריך את פונקציית הגן האוטונומית של התא בשליטה, טבעי סביבה. בסופו של דבר, פרוטוקול האלקטרופורציה המפורט, שלב-אחר-שלב משמש להשגת הקדמה מוצלחת של פלמידים למספר רב של תאים ependymoglial בודדים.
Introduction
בכדי לבחון התחדשות מוחית. לאחר פציעה בפצע דקירה בהשוואה ליונקים, על הסולם האבולוציוני, מינים מפותחים פחות כגון דג זברה בדרך כלל להציג שיעורי גבוה יותר של נוירוגנזה ואזורים נרחבים של מגורים מבוגרים תא גזע עצבי, המוביל לדור קבוע של נוירונים חדשים ברחבי רוב אזורי המוח בחיים הבוגרים. תכונה זו מופיעה בתיאום עם קיבולת משובי גבוהה באופן משמעותי של דג דג זברה בהשוואה ליונקים1, כמו דג זברה יש פוטנציאל מדהים ליצור ביעילות נוירונים חדשים ברוב מודלים של פגיעה במוח למדו2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה כאן מחקר הדגים הזינצאלון נלמד, שכן הוא אזור מוחי עם נוירוגנזה בולטת בבגרות. אזורים אלה של נוירוגנזה למבוגרים הם הומוולוגי לאזורים נוירוגניים במוח היונקים הבוגרים9,10,11.
שופע באזורים נוירוגניים ב-דג זברה telencephalon נוכחים בשל קיומו של הרדיאלי glia כמו תאים או תאים ependymoglia. Ependymoglial תאים לפעול כתושב תאי גזע עצביים למבוגרים ואחראים על הדור של נוירונים חדשים במוח שלמים ומתחדשות3,5. ניסויים מעקב השושלת הראו כי ependymoglia חדרית להגיב לפציעה, לאחר מכן מתרבים וליצור חדש neuroblasts נמשך להגר לאתר הנגע5. בשל טבעו הטבעי של הדגים הזינצאלון, תאים ependymoglial קו המשטח החדרית ולבנות את הקיר החדרית הגייתי. הקיר הבין-חדרית נוצר על ידי שכבת תא ependymal (איור 1A). וחשוב מכך, דג זברה ependymoglia לגלם את המאפיינים של שני היונקים הרדיאליים והתאים ependymal. תהליכים רדיאליים ארוכים הם תכונה טיפוסית של תאים הרדיאלי של גליה, ואילו הרחבות סלולר וצמתים הדוקים (כמו גם המיקומים החדרית שלהם) הם תכונות טיפוסיות של ependymal תאים12,13,14. לכן, תאים אלה נחשבים לתאים ependymoglial.
כדי לעקוב אחר התנהגות vivo של תאים בודדים ependymoglial במהלך התחדשות, הם צריכים להיות מתויג באופן אמין. שיטות שונות של vivo תא תיוג עבור מיקרוסקופ פלורסנט תוארו בעבר, כגון כתבים אנדוגני או צבע ליפופילית15. שיטות אלה, בניגוד לאלקטרופורציה, עשויות לדרוש פרקי זמן ארוכים יותר ולעתים קרובות אינן מציעות אפשרות של תיוג תאים בודד או מעקב קבוע לטווח ארוך. אלקטרופורציה, עם זאת (מלבד תוויות תא יחיד), מציעה את האפשרות של החדרת DNA חדש לתא המארח. יתר על כן, לעומת שיטות אחרות של העברת DNA לתוך התאים, אלקטרופורציה הוכח להיות אחת השיטות היעילות ביותר16,17,18,19.
מוצג כאן הוא פרוטוקול אלקטרופורציה כי כבר מעודן לצורך תיוג תאים ependymoglial בודדים בתוך המבוגר הדגים telencephalon. פרוטוקול זה מאפשר תיוג של תאים ependymoglial יחיד כדי לעקוב אחריהם לאורך תקופה ארוכת טווח20 או לטפל מסלולים ספציפיים באופן אוטונומי התא21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול אלקטרופורציה זו הוא שיטה אמינה בvivo לתיוג תאים בודדים ependymoglial. הפרוטוקול עשוי להזדקק לעיבוד נוסף כדי לתייג סוגי תאים אחרים כגון נוירונים או oligodendrocytes הפוך. כדי להשיג תוויות מוצלחות, ניתן להשתמש בפלמידים המכילים היזמים שונים. עוף בטא אקטין מיזם, eF1alpha, cmv ו מקדם אוביקוויב השתמשו בעבר ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודות מיוחדות לג Copti לעריכת כתב היד. אנו גם מממנים בהכרת תודה ל JN מקרן המחקר הגרמני (DFG) על ידי SFB 870 ו SPP ניתוח אינטגרטיבי של Olfaction “ו SPP 1738” תפקידים מתעוררים RNAs ללא קידוד בפיתוח מערכת העצבים, פלסטיות & מחלה “, SPP1757” Glial טרוגניות “, ואסטרטגיית מצוינות במסגרת אשכול מינכן לנוירולוגיה מערכות (EXC 2145 סינרגיה-ID 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. . In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. . Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
